浅析检测食品大肠菌群质量控制的体会

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由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一。大肠菌群数检出的高低表明了粪便污染的程度以及食品卫生的质量，也反映了对人体健康危害性的大小。食品大肠菌群检验的对象是有生命的，由于周围生活环境的改变，可以产生生理特性上的变异。在鉴定上，主要特性反应的程度也有差别。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。从提高食品大肠菌群检测的准确性出发，根据实际工作中的体会做一介绍。

l、实验室前阶段的质量控制

操作者采样必须在无菌操作下进行。送检应予以重视，放置过久，菌数将明显增加。样品送到微生物检验室应越快越好。如果路途遥远，可将不需冷冻的样品保持在l℃～5℃的环境中(如冰壶)。如需保持冷冻状态，则需保存在泡沫塑料隔热箱内(箱内有干冰，可维持在0℃以下)。总之，送检时间与检验开始时间之间越短越好，减小人为误差。

2、仪器质控

每天工作前、下班时应记录培养箱和冰箱的温度。培养箱为36℃±1℃，冰箱2℃～8℃。使用高压蒸气灭菌器时，要先排除器内冷空气。排气管见有蒸气排出后，再关闭放气阀。经常观察核对压力表与温度计在高压灭菌时是否一致。为防止灭菌不够，可用化学及生物学质控指示物做监测指标。

3、培养基质控

保存制备的培养基应放冰箱(2℃～8℃)保存。为了避免水分过快地丢失，应放在严密的有盖容器内或塑料袋内。平板内培养基可保存两周左右，试管内培养基可保存l～2个月。使用新批号培养基或自制的新培养基，必须用标准菌株进行核对，观察性能。伊红美兰琼脂平板可用大肠埃希氏菌和福氏痢疾杆菌，菌液4×104倍稀释后接种，36℃24 h培养，大肠杆菌生长，分解乳糖，菌落兰紫色。福氏痢疾杆菌生长，不分解乳糖，菌落无色，半透明。

4、试剂的质量控制

新配制的革兰氏染色液要记录时间。配制后必须选用适当的标准菌株作阳性及阴性对照来鉴定性能。经常使用的，要一周核对一次。阳性对照可用金黄色葡萄球菌，阴性对照用大肠埃希氏菌。应努力掌握染色技术及把握脱色时机。遇到有些菌株革兰氏染色难以判断时，可用0．535 mol／L(3％)KOH试验加以区分。方法：取0．535 mol／L(3％)KOH液一小滴滴于玻片上。用接种环取菌放其中研磨混匀，1 min能挑起粘丝者为革兰氏阴性菌，反之为革兰氏阳性菌。

5、检验程序的质量控制

5.1所有检验均必须无菌操作，同时作空白对照接种环每次使用前后均应火焰彻底灭菌，但接种时一定要注意冷却，否则本应检出的样品可能发出未检出的报告。

5．2大肠菌群检验程序分三步

现行的国家标准主要采取三个实验步骤法，它们分别是分离培养、乳糖发酵试验及证实试验。分离培养是把产气发酵管中的培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，在36±1℃温度下进行培养，观察18―24小时中观察菌落的形态，同时观察在36±1℃温度下，培养48±2h内培养物是否产生了气。乳糖发酵试验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性管，经过平板分离和证实试验后，有可能成为阴性。大量检验数据表明，食品中大肠菌群检验程序的符合率，初发酵与证实试验相差较大，不同食品三步程序的符合情况也不一致，所以在大肠菌群检验程序方面，应结合食品类别，污染情况及样品中菌相的差别分别予以考虑。只做一步初发酵对某些食品来说，误差是比较大的。这样做，会有相当部分的合格样品被作为不合格样品处理，应予注意。

5．3挑选菌落

挑取平板上的可疑菌落，然后进行革兰氏染色观察。同时，还要观察接种乳糖发酵管的检测物在36±1℃温度下培养24±2h的产气情况。根据证实为大肠杆菌阳性的管数,查MPN表报告每100ml(g)大肠菌群MPN值，然后根据实物标准，判断大肠杆菌是否超标。在实际工作中，为了提高大肠菌群的检出率，应当熟悉大肠菌群的菌落色泽和形态。在检验中，选用伊红美兰平板为分离培养基。在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽，检出率高；菌落大小、湿润与干燥、光滑与粗糙、边缘隆起情况也应注意，但不如色泽重要。另外，挑取菌落数的多少与大肠菌群的检出率有密切关系。在实际工作中，由于工作量较大，通常只挑取一个菌落，这样很难避免假阴性的出现，尤其当菌落不典型时。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。

5.4产气量

在实际工作中，大肠菌群的产气量，多者可以使倒管全部充满气体，少者可以产生小于米粒的气泡。一般来说，产气量与大肠菌群检出率成正相关，但随样品种类而有不同。有小于米粒的气泡，也可有阳性检出。根据大量工作实践，对未产气的乳糖发酵管是否按阴性处理，应慎重考虑。在日常工作中，经常可以遇到在初发酵时产酸无气，但复发酵却证实为大肠菌群阳性。有时倒管内虽无气体，但在液面及管壁却可以看到缓缓上浮的小气泡。所以对未产气的乳糖发酵管如有可疑时，可用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，而应作进一步观察，这种情况的阳性检出率可达半数以上。由原因二造成的还有补救措施——将留有气泡的管放冰箱冷藏一段时间。最后提醒大家注意，试管口和试管塞不要沾上培养基，包括试管壁培养基没有淹没的部分，更不能将试管倒置，这样很可能造成污染。

参考文献

[1]沈玉清，王振涛．实验室管理学[M】．中国医药科技出版社，

[2]食品卫生学检验 大肠菌群计数 GB4789.3-2010

[3]食品卫生检验 吉林农业大学出版社