双因子诱导轴型支架血管化的组织形态学研究

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[摘要] 目的 以血管内皮生长因子（VEGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）复合同轴双层聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架并包裹股动静脉血管束，观察血管再生与成熟及支架早期血管化的动态变化。方法 将18只3月龄成年

雄性新西兰大耳兔随机分为3组：实验组（8只）、实验对照组（8只）和空白对照组（2只）。解剖分离兔的股动静脉血管束，将其包裹于溶液浇铸-颗粒沥取法制备的同轴双层PLGA支架中央。实验组支架的外层加注PDGF，内层加注VEGF；实验对照组支架的外层为空白，内层加注VEGF；空白对照组不予特殊处理。实验组及实验对照组于支架植入术后第7、10、14、21天观察新生血管的形态特征，空白对照组于支架植入术后第7、10天观察作为对照。结果 术后第7天，实验组及实验对照组股动静脉血管束可见少量呈放射状分布的血管芽；术后第10天，两组大量的新生血管芽沿支架孔隙空间向内层支架放射状生长并贯通支架全层，密度由内向外梯度递减；术后第14天，实验组血管壁较厚，呈分层结构，实验对照组以单层内皮样细胞衬里的幼稚血管为主；术后第21天，实验组支架内以成熟血管为主，而实验对照组血管数量明显减少。空白对照组始终未见明显血管结构。结论 同轴双层PLGA支架复合VEGF/PDGF可有效促进早期血管化。

[关键词] 骨组织工程； 血管化； 动静脉血管束； 血管新生

[中图分类号] Q 81 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.022

组织工程骨因具有无抗原性、来源不受限制、可预先设计塑形和具有生物功能等独特优势，而具有广阔的发展前景。但如何提高并确保骨组织工程的早期血管化，迄今仍是影响其规模化及实用性的瓶颈之一[1-3]。组织工程血管化的关键是功能血管的数量及其营养能力，而不是仅仅在于成功诱导新生血管的总量。真正有实际价值的早期血管化过程，应既能诱导新生血管在支架空间结构内大量增殖，又能在此基础上进一步促进其结构成熟以形成稳定有效的血循系统[4]。本研究设计同轴双层聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]支

架，将血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）分别复合于内外层支架形成空间差异分布方式，并将股动静脉血管束包裹于支架中央，观察支架内部早期诱导血管化的效能及其时间-空间动态变化与转归。

1 材料和方法

1.1 同轴双层PLGA支架的制备

将PLGA（聚乳酸∶聚羟基乙酸为50∶50，相对分子

量50×103，固有黏度0.24 dL·g-1，山东医疗器械研究所）及粒径150～300 μm的氯化钠颗粒混匀溶于氯仿，浇铸于轴型模具[5]内，按溶液浇铸-颗粒沥取法[6]制备大小两套中空管状支架各18套，套迭形成双层结构。Co60 25 kGy辐照灭菌，-20 ℃保存。

1.2 股动静脉血管束分离及支架植入

将18只3月龄成年雄性新西兰大耳兔（天津医科大学动物实验中心提供，体重2.0～2.5 kg）随机分为3组：实验组（8只）、实验对照组（8只）和空白对照组（2只）。全身麻醉下于兔左侧中份纵行解剖游离股动静脉血管束，结扎分支，显露约2.5 cm，包裹于植入体内的同轴双层PLGA支架的中央管腔内。根据分组，实验组双层轴型PLGA支架的外层用微量注射器加注含PDGF 0.5 ng的溶液50 μL，内层加注含VEGF 0.5 ng的溶液50 μL；实验对照组的支架外层为空白，仅在内层加注含VEGF 0.5 ng的溶液50 μL；空白对照组植入支架不予特殊处理。将支架与毗邻肌合固定，分层严密缝合。

1.3 标本取材及检测

实验组及实验对照组分别于支架植入后第7、10、14、21天各取2只动物处死，切取包含支架周缘5 mm肌肉组织在内的完整组织块。-20 ℃直接冰冻包埋后行7 μm切片及苏木精-伊红（hematine-eosin，HE）染色，观察新生血管的形态特征。空白对照组于支架植入术后第7、10天各取1只动物，进行对比观察。

2 结果

术后第7天，实验组（图1A）与实验对照组（图1B）表现相近，均可见VEGF诱导下，股动静脉血管外壁向内层支架多孔间隙内呈放射分布方式，长入条索状新生组织，周围植床组织亦可见少量纤维样组织长入外层支架孔隙，新生组织分布以内、外层支架表浅区域为主。高倍镜下股动静脉血管束可见少量由单层内皮样细胞衬里的幼稚血管芽。空白对照组（图1C）仅见少量纤维组织，未见明显血管结构。

术后第10天，实验组（图2A、B）、实验对照组

（图2C、D）标本可见大量新生血管芽广泛长入支架

内部，沿支架孔隙空间向内层支架放射状生长，走行呈迂曲状，贯穿支架内外全层，血管外周的纤维结缔组织基质丰富，新生血管密度由内层支架表面向外梯度递减。两组对比可见，实验组近外层支架

（PDGF）区域内新生血管的管径较粗且管壁较厚，腔

内聚集血细胞，近内层支架（VEGF）区域内的血管则以单层内皮样细胞衬里的幼稚血管结构为主，内含少量血细胞；实验对照组仍多为单层内皮样细胞衬里的幼稚血管。空白对照组（图2E）仅见少量纤维组织，未见明显血管结构。

术后第14天，实验组（图3A、B）标本可见双层支架腔隙内广泛分布新生血管网络并贯穿全层，其管壁较厚且结构较成熟圆润，清晰可见逐步过渡的内、中、外膜分层，同时可见少量幼稚血管。实验对照组（图3C、D）则以单层内皮样细胞衬里、形状

较不规则的幼稚血管为主，成熟血管相对较少。

术后第21天，实验组、实验对照组血管密度均降低，实验组支架内以成熟血管为主（图4A），沿新生血管轴的纵剖面尚可见血管芽（图4B）或丰富分支架构，管腔内含有大量的血细胞，支架内可见少量血细胞。实验对照组（图4C、D）管径较粗的血管数量较实验组明显减少，支架内可见大量散逸的血细胞。

3 讨论

皮肤、软骨及角膜等少数组织细胞可通过周围血管的扩散而得到充分的氧气和养分[3]。但这种扩散

能力仅限于血管周围200 μm范围之内。对于骨、肌肉等较大工程组织的成功应用，血管化问题尚待进一步解决[7]。当组织工程支架植入体内时，虽因手术

创伤引起的炎症反应和支架内部种子细胞在缺氧条件下释放的成血管因子可共同诱导支架血管化，但此方式形成血管的速度较慢，无法转运充分的氧气和养分至支架内部的种子细胞。因此学者[4]通过改变

支架构型设计、复合诱导血管再生细胞因子、体内外预血管化等方式促进工程组织的血管化进程。

诱导骨组织工程血管化的关键是要形成结构成熟、功能稳定、能够长期提供血运的循环系统，因此，血管新生应包括两方面：内皮细胞的迁徙、增殖及周细胞维持新生血管芽的稳定[8]。只有依靠早期

形成的有效血循网络，方可在组织工程支架内，为受控的组织细胞分化增殖及最终形成具有预期形态及功能的组织/器官提供有效的供氧/供养功效。

Richardson等[9]认为VEGF在血管化早期促进血

管新生，PDGF在血管化后期诱导血管成熟，联合应用这两种因子将能更好地促进血管的再生与成熟。在组织工程领域，构建一个具有复杂功能的组织，其关键是要精确地协调好干细胞所处微循环环境的时间及空间变化。本研究中，将股动静脉血管束包裹于构建的同轴双层PLGA支架中央作为轴型血供来源，通过在其外层复合PDGF、内层复合VEGF的设计方式，使两种分别作用在血管形成不同时期的诱导因子利用空间分布的差异方式，形成对血管组织诱导再生的时间差异效应。VEGF接近股动静脉，利于早期诱导大量血管芽生及幼稚血管生成。PDGF位居外层，利于促进后期放射状向外生长，并促进最终与周围组织血循沟通的新生血管结构的成熟与稳定。事实上，这种后期的血管成熟与稳定，才是真正有意义的支架血管化的组织结构基础。与此同时，在外层管壁支架上的PDGF，还依赖渗透方式逐步作用于较靠内的新生血管丛，使之最终稳定下来。

本研究结果显示，实验组第10天时，随着两种因子在双层支架内部逐渐形成的不同浓度梯度，由外层支架到内层支架可见新生血管由成熟到幼稚。第21天时，实验对照组新生血管密度较前明显降低。动静脉血管束早期在VEGF的诱导下，支架内部形成大量的幼稚血管，这些幼稚血管成熟之前在VEGF的持续作用下可以避免退化及内皮细胞凋亡。但随着VEGF的逐步降解，新生的幼稚血管急剧退化而大量血细胞残存于支架内部。实验组早期在VEGF诱导下大量新生幼稚血管伴随纤维组织贯穿双层支架，后期在PDGF作用下，幼稚血管逐渐改建成熟，虽然VEGF和PDGF不断降解，但仅少部分未成熟的新生血管逐渐退化，最终形成贯通双层支架内部的成熟稳定的循环网络。

在VEGF及其他成血管因子的诱导下，内皮细胞释放基质金属蛋白酶降解周围的细胞外基质，内皮细胞增殖并向高浓度因子部位迁徙[10]，内皮细胞迁

徙至降解后形成的腔隙最终形成新生血管。其过程受黏附蛋白、生长因子、连接分子、内源性抑制分子等的联合作用[11]。新生血管进一步改建为成熟血

管则需要多种功能不同因子之间的相互作用[10]，但

是Greenberg等[12]发现在诱导组织工程血管化过程中

联合应用VEGF和PDGF并不能获得持久的血管效应，认为VEGF受体2抑制PDGF受体β信号通路，进而干扰血管平滑肌功能及血管成熟。关于不同因子之间的协调机制，尚须从分子层面及细胞信号通路方面等进一步研究。

本研究表明：同轴双层PLGA支架构建方式可显著改善组织工程支架内部的早期血运环境，提高氧气和养分的输送效能。

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