戊己水煎液对幽门螺杆菌感染胃上皮细胞凋亡的作用

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摘要：目的：探讨戊己水煎液(和荆局方)对幽门螺杆菌(H・pylori)感染的SGC-7901细胞凋亡的作用。方法：将H・pylorl接种于SGG-7901细胞，然后加入不同浓度的戊己水煎液，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测SGC-7901细胞凋亡的组蛋白DN断。结果：不同浓度的戊己水煎液组其细胞凋亡与对照组比较有显著差异(P

关键词：幽门螺杆茵；和剂局方戊己水煎液；SGG-7901细胞：细胞凋亡

中图分类号：R285.5　文献标识码：A　文章编号：1673-7717(2007)11-2365-03

幽门螺杆菌(Hellcobacter pylori，H・pylori)是一种寄居在人胃内的革兰氏阴性微需氧细菌。自从1983年澳大利亚学者分离和培养H・pylori以来，人类对H・pylori的认识不断深入。近年来发现H・pylofi是胃十二指肠溃疡的主要致病因素。体内外研究显示H・pylori感染可能是胃癌发生的重要因素1994年WHO将其确立为I类致癌因子。

中药经方戊己丸(《太平惠民和剂局方》)，是传统治疗胃部疾患的良好方剂。在治疗慢性胃炎、消化性溃疡的临床观察中其疗效早有报道，但是治疗机理尚不十分清楚。本实验欲从体外探讨戊己丸对H・pylori感染和胃黏膜上皮细胞凋亡的关系。现将实验结果报道如下。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　茵株和细胞H・pylofi采用国际标准菌株SS1(sydney strain 1)，该菌株含有细胞空泡毒素(VacA)和细胞毒素相关基因(CagA)。人胃上皮细胞系SGC-7901细胞引自中南大学湘雅医学院细胞实验中心。

1.1.2　实验药物

戊己水煎液成分即取自戊己丸(由黄连、吴茱萸、白芍3药等比例组成)，由湖南中医药大学药学院植物药化学分析研究室与药物制剂研究室制备(浓度1g／mL)。抗生素混合液(万古霉素10mg／L，两性酶素B2mg／L，多黏膜菌素B 0.25mg／L)自配。

1.1.3　实验试剂

空肠弯曲菌琼脂基础(上海腹泻病控制上海试剂供应研究中心)。RPMI 1640培养液(USA GIB-CO)。小牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)。胰蛋白酶、DMSO(USA Difco公司)。ELISA细胞凋亡试剂盒(德国宝灵曼公司，Gat.NO.1794223)。Triton X-100(北京鼎国生物技术发展公司)。

1.1.4　实验仪器

WMZK-02型厌氧培养箱，浙江义乌冷冻机总厂。x―sB―1A型倒置显微镜，广西梧州光学仪器厂。3111型C02水套培养箱，USA FORMA。TECANSUNRISE型酶标分析仪，奥地利。高速冷冻离心机(TGL16M)，长沙科威实业有限公司。

1.2 方法

1.2.1　H・pylori的活化取0.1mL冻融的H・pylofi菌置于改良Skirrow琼脂培养基平板上，涂布均匀，于37℃微需氧环境(N285％，C0210％，O25％)培养72h。

1.2.2　细胞培养SGC-7901细胞用含20％小牛血清的RPMI 1640培养液进行培养。转种时调整细胞的密度(1×105／mL)。

1.2.3　细胞凋亡的测定ELISA方法检测：参照Hated方法检测凋亡细胞组蛋白DN断。将SGG-7901细胞(1×105／mL)转种至小青霉素瓶中培养，24h后用HankS液清洗细胞2次，然后用RPMI 1640完全培基(不加双抗)配成的不同浓度的戊己水煎液(1:160、1:320、1：640、1：1280)和H・pylori菌悬液(浓度为l×107CFU／mL)加入生长状态良好，长满单层的细胞中，药液每孔加0.9mL,菌悬液每孔加0.1mL，每瓶液体体积1mL。于37℃，微需氧环境培养。24h后低温低速离心10min(200r／min，4℃)，弃上清。细胞沉淀加200μL细胞裂解液Triton x-100(用PBS配制成0.1％的浓度)，室温下孵育30min，低温低速离心10min(200r／min，4℃)，取上清液20μL于酶标板各孔中，另一孔加20μL组蛋白－DNA复合物作为阳性对照。各孔中加80μL免疫反应复合物(生物素标记抗组蛋白抗体：过氧化物酶标记抗DNA抗体：孵育缓冲液=1:1:18，临用前配制)混匀，盖上封片，室温下振荡反应2h。倾去各孔内液体，加250μL孵育缓冲液洗涤各孔，共洗3次，加100μL底物液，另加一孔底物液作为比色空白对照，于室温下振荡反应10min。采用双波长比色测定法(主波长405nm，参考波长492nm)，组蛋白一DN断含量以吸光度(OD值)表示(严格按照说明书操作)。

2 结果

ELISA方法检测细胞凋亡：选用1×107CFU／mL作为细菌的实验浓度，然后加入不同浓度的戊己水煎液(1:160、1:320、1:640、1:1280)，细胞内组蛋白-DN断含量的变化见表1。

从表1可以看出，在戊己水煎液浓度为1:160、1:320、1:640时均可以减少H・pylori诱导的SC,C-7901细胞的凋亡，与阳性对照组比较有显著性差异(P

3　讨论

细胞凋亡是在一定的生理和病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控而使细胞自动消亡的过程。近年来发现H・pylofi感染与胃癌的发生有密切的关系，但其确切的致病机制尚不清楚。已有研究表明细胞凋亡即使不是唯一的也是主要的胃肠道上皮细胞死亡方式。细胞凋亡异常与包括肿瘤在内的一系列疾病的发生有关。

H・Pylori感染诱导胃黏膜上皮细胞凋亡有Moss等最先报道。Peek等。报道，H・pylori感染可诱导胃黏膜上皮细胞凋亡，并认为与H・pylori的CagA和VacA有关。Jones等观察到，在H・pylori感染的胃炎患儿胃上皮细胞的凋亡指数比无胃炎的对照组高，随着H・pylori的根除，凋亡指数也下降。H・pylofi诱导的凋亡在体外培养的胃上皮细胞中同样也可以得到证实。Maeda等发现H・pylori能直接诱发细胞凋亡。LipkinI认为胃肠道黏膜细胞凋亡的调节紊乱参与了癌症的起始过程，并对其发生发展起着负调控作用。Anti等研究发现，H・pylori感染诱导细胞凋亡的增加主要发生于胃黏膜病变的早期，细胞凋亡可能是胃上皮细胞对H・pylori感染的初始反应。H・pylori感染可能作为一种始动因子，作用于胃癌发生的初始阶段，通过诱导细胞凋亡导致细胞凋亡与增殖之间的失衡来促进胃癌的发生。

杨艺等用体外细胞的培养技术，观察H・pylori对胃上皮细胞生长的影响，结果显示H・pylori以浓度依赖方式诱导胃上皮细胞凋亡。张志广等的研究表明，H・pylori阳性的慢性胃炎患者胃黏膜上皮细胞凋亡指数明显高于正常胃黏膜，且细胞凋亡指数与胃黏膜炎症程度无关，提示H・pylofi感染本身可以刺激胃上皮细胞的凋亡。姜海行等证实H・pylori超声波提取液可在体外诱导大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡，并提示H・pylori感染可通过干扰胃上皮细胞增殖与凋亡之间的平衡在胃癌病因中发挥作用。

本实验的结果表明，中药复方戊己水煎液具有减少H・pylori诱导的SGc-7901细胞凋亡的作用。这可能是由于戊己水煎液可以抑杀H・pylori，减少H・pylori对SGG-7901细胞的接触，从而减少细胞凋亡的结果。这提示H・pylori与细胞凋亡密切相关。大量的细胞凋亡可能是H・pylori感染致胃十二指肠疾病形成的机制之一。因此，寻求有效的根除H・pylori的药物以减少细胞凋亡的发生，将有利于提高H・pylori相关的胃十二指肠疾病的治愈率，从而达到预防胃癌的发生。