白藜芦醇保护三氧化二砷引起的心肌毒性的实验研究
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[摘要] 目的 评估白藜芦醇在预防三氧化二砷（Arsenic trioxide，As2O3）引起心肌损伤方面的作用。 方法 50只雄性Wistar大鼠随机分为5组：正常对照组（单独给予生理盐水），As2O3对照组（单独给予As2O3），白藜芦醇低剂量组（白藜芦醇5 mg/kg+As2O3）、白藜芦醇中剂量组（白藜芦醇15 mg/kg+As2O3）、白藜芦醇高剂量组（白藜芦醇45 mg/kg+As2O3）。所有治疗均隔1天进行，第6天处死大鼠。用标准肢体Ⅱ导联测定大鼠心电图变化；测定大鼠血清中肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenasem，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；光镜下观察心肌组织结构变化；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）比色法测定As2O3和白藜芦醇抗肿瘤效应。 结果 ①与正常对照组相比，As2O3对照组大鼠血清CK、LDH活力显著升高，MDA含量升高，SOD及GSH-Px活力下降，具有显著性差异（P < 0.05）。②白藜芦醇各剂量（5、15、45 mg/kg）均能减轻As2O3引起的上述改变，与As2O3对照组相比，可降低血清CK、LDH活力及MDA含量，增强血清SOD及GSH-Px活力，以白藜芦醇高剂量组作用最为显著。③光镜下见白藜芦醇可减轻心肌组织结构损伤，白藜芦醇的治疗作用以高剂量组最为显著。④体外研究证实白藜芦醇可增加As2O3的抗肿瘤作用。 结论 ①As2O3引起心脏毒性的发生机制可能与氧自由基及其诱导的脂质过氧化有关。②大剂量白藜芦醇对As2O3所致心脏毒性具有预防作用，其机制可能与其提高机体内抗氧化酶活性及拮抗脂质过氧化有关。
[关键词] 白藜芦醇；三氧化二砷；心脏保护作用；抗氧化作用
[中图分类号] R969 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）08（c）-0004-05
三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）在治疗难治性或复发性早幼粒白血病时显示了很好的效果[1]，但其严重的心脏毒性限制了其临床应用，心脏毒性主要表现为QT间期延长，从而导致尖端扭转型室性心动过速及心脏骤停，所以部分患者不能接受高剂量的As2O3治疗。As2O3导致心脏毒性的可能机制为DNA修复和甲基化、活性氧的产生、心肌离子通道的改变和凋亡[2]，因此，活性氧的清除及抗氧化物的应用可能是一种预防As2O3心脏毒性的有效途径[3]。
白藜芦醇天然存在于葡萄、桑椹、花生及红酒中[4]，具有雌激素、抗血小板、抗肿瘤及抗炎的功效[5]，被认为是一种潜在的心脏毒性保护药物[6]，在不同细胞系的研究中均发现其能发挥清除保内活性氧的作用[7]。据此，笔者就白藜芦醇预防As2O3引起心脏毒性的做用做一研究，同时对二者的抗肿瘤作用进行观察。
1 动物与试剂
1.1 实验动物
健康雄性Wistar大鼠50只，体重220～270 g，由上海斯莱克实验动物公司提供，SPF级。大鼠适应性喂养1周，饲养在恒温（23±2）℃，湿度0.50～0.60、人工光照明暗各12 h的饲养室内，标准饲料和自来水自行取用。人A549肺腺癌细胞株来源于蚌埠医学院中心实验室。
1.2 试剂
白藜芦醇（晶体），西安飞达生物技术有限公司，含量为98.5%，批号：050910；As2O3为哈尔滨伊达药业有限公司产品，用无菌水配成1 mg/mL液备用，4℃保存；肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）及丙二醛（MDA）测试盒均由南京建成生物工程研究所提供。
2 方法与结果
2.1 方法
2.1.1 动物分组及给药方法 健康雄性Wistar大鼠50只，随机分为5组：正常对照组，As2O3对照组，白藜芦醇低、中、高剂量治疗组，每组各10只大鼠。白藜芦醇低、中、高剂量组分别以等容量不同浓度白藜芦醇混悬液，按5、15、45 mg/kg剂量于第1、3、5天灌胃，白藜芦醇给药后1 h从大鼠尾静脉给予As2O3（1 mg/kg）。正常对照组予等容量生理盐水（2.5 mL/次）于第1、3、5天灌胃，AS2O3对照组于第1、3、5天从大鼠尾静脉给予AS2O3（1 mg/kg）。
2.1.2 心电图记录 给药前及给药后每24小时记录大鼠标准肢体Ⅱ导联心电图，QTc间期计算公式如下：QTc=QT/（RR/100）1/2。QTc间期是指按心率校正的QT间期，RR为大鼠的心率。
2.1.3 标本采取方法 给药结束后第2天，腹腔注射10%水合氯醛行全身麻醉，剂量为4 mL/kg 。3～5 min后动物麻醉完毕。仰卧位固定于硬质木板上，剖开胸腔，打开心包，暴露心脏，以无菌5 mL注射器行心脏右心室穿刺采血（进针4～5 mm），保持注射器位置不动，以恒定匀速的抽吸力缓慢抽血3～4 mL，注入待离心的10 mL无菌玻璃离心管中。静止1 h后低温离心（4℃，3000 r/min，10 min），以微量移液器吸取上清注入无菌EP管中，贮存于4℃冰箱待检，留取大鼠的心脏，10%甲醛固定以备组织病理学检测。
2.1.4 血清心肌损伤指标的测定 按照试剂盒使用说明书操作测定血清LDH、CK活力。LDH及CK测定均采用比色法。实验加样完毕后采用WFZ8002D紫外可见分光光度计比色计值。
2.1.5 血清氧化损伤指标的测定 按照试剂盒说明书操作测定血清SOD、GSH-Px及MDA值。SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法，GSH-Px采用二硫代二硝基苯甲酸直接法，MDA测定采用硫代巴比妥酸法。均采用WFZ8002D紫外可见分光光度计比色计值。
2.1.6 心肌组织学改变 切取左、右心室组织，以乙醇脱水后石蜡包埋，常规制片，苏木精-伊红（HE）染色。以OLYMPUS图像采集系统进行病理图像采集。在光学显微镜下观察心肌组织学改变，主要观察以下病理改变：心肌细胞改变；心肌血管充血；出血；退变；坏死。
2.1.7 四甲偶氮唑盐比色法（MTT）法检测细胞增殖能力 采用MTT法测定白藜芦醇、As2O3单药及两药联合对A549细胞增殖的抑制效应。将对数生长期细胞以1×105/孔接种于96孔培养板中，每孔总体系0.1 mL，每个样品接种8孔。将细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/mL链霉素的DMEN培养液培养，在饱和湿度，37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h，加入相同容积白藜芦醇（10 μmmol/L）及As2O3（70 μmmol/L），继续孵育48 h。然后每孔中加入新鲜配制的MTT工作液20 μL（终浓度0.5 mg/mL）继续培养4 h，小心吸弃上清，每孔加入DMSO 0.2 mL，震荡5 min至混匀，用酶标仪测定570 nm波长处的吸光度（A）值，按下列公式计算细胞增殖抑制率：细胞存活率（%）=（A对照值-A实验值/A对照值）×100%。
2.1.8 统计学方法 采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较应用SNK-q检验分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2.2 结果
2.2.1 各组间QTc的变化 As2O3治疗组在24 h和72 h时两个时间点QTc明显延长（P < 0.01）。经白藜芦醇预处理后，在这两个时间点均可减弱QTc的延长（P < 0.05），其中以中高剂量较明显。生理盐水对照组未发现任何异常心电图变化。见图1。
2.2.2 血清CK及LDH活性变化 实验结果表明，As2O3对照组大鼠血清CK及LDH活力均显著高于正常对照组（P < 0.05）。白藜芦醇中、高剂量组的CK和LDH活力较As2O3对照组明显降低（P < 0.05），但尚未降至正常。低剂量组与As2O3对照组比较虽有差异，但无统计学意义（P > 0.05），白藜芦醇各剂量组的治疗作用表现出良好的剂量依赖性。见图2、3。
2.2.3 血清SOD活性、GSH-Px活性及MDA含量变化 与正常对照组比较，As2O3对照组血清SOD及GSH-Px活性显著下降（P < 0.05），血清MDA含量明显增加（P < 0.05）。白藜芦醇低、中、高剂量组的大鼠血清MDA含量明显下降，其作用呈现良好的剂量依赖性。白藜芦醇各剂量组血清SOD活力GSH-Px活性均升高，与As2O3对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。白藜芦醇低、中、高剂量组组间比较发现，低剂量组与中剂量组间血清SOD水平差异无统计学意义（P > 0.05）。但白藜芦醇高剂量组与低、中剂量组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见图4～6。
2.2.4 心肌组织学改变 光镜下观察可见，正常对照组心肌组织结构层次清晰，心肌细胞排列整齐，胞浆丰富，胞膜完整，核清晰可见，呈长圆形，无病理改变（图7）；As2O3对照组心肌组织损伤明显，心肌细胞排列紊乱，肌间隙变宽，并可见多处心肌细胞大片重度凝固性坏死灶，胞核固缩、变形或溶解，胞膜受损，胞浆深度红染（嗜酸性）。心肌纤维束间的血细胞提示坏死灶内外大量出血，心脏的左、右室壁，室间隔，心内膜下及肌均可累及（图8）。白藜芦醇能够减轻As2O3诱导的大鼠心脏心内膜及心肌区病理学变化，其治疗作用呈良好的剂量依赖性（图9～11）。
2.2.5 三氧化二砷与白藜芦醇抗肿瘤效应 As2O3在浓度为70 μmmol/L时对A549细胞的抑制率约为50%，而白藜芦醇（10 μm）约为15%，白藜芦醇可增加As2O3的抗肿瘤能力，二者联合对A549细胞的抑制率约为76%，显著高于单独应用As2O3时的抑瘤率（P < 0.05）。见图12、13。
与单独应用三氧化二砷组比较，*P < 0.05；“+”表示实验组中加入三氧化二砷或白藜芦醇；“-”表示实验组中未加入三氧化二砷或白藜芦醇
图13 三氧化二砷与白藜芦醇抗肿瘤效应比较柱形图
3 讨论
As2O3作为中药砒霜的主要有效成分，长期以来被认为是有毒致癌物，但其作为药物应用已有2400多年历史。20世纪70年代，哈尔滨医科大学第一临床医学院首先应用其来治疗急性早幼粒细胞白血病取得成功后，进一步证实能够抑制胃癌、肺癌、前列腺癌、肝癌等实体瘤的生长。其作用机制包括：抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，影响肿瘤血管生成，提高机体免疫力，逆转肿瘤多药耐药性等。2000年9月As2O3被美国FDA同意用于治疗复发或难治性早幼粒白血病，目前As2O3已成为治疗复发或难治性早幼粒白血病最有效药物之一。但是其剂量依赖毒性限制了应用。据报道：约50%的患者在应用As2O3后均可引起QT间期延长，导致严重室性心律失常，其中1/3的患者发生尖端扭转型室性心动过速[8-9]。另外，As2O3还可引起窦性心动过缓、非特异性ST-T段改变、心包积液及完全性心脏传导阻滞[9]，也在给予24 h内患者发生突发性心脏猝死的报道[10]。与其他临床试验报道一致[11-12]，本研究结果也显示：在给予As2O3后大鼠QTc相应延长，心肌细胞细胞质空泡化及心肌纤维变化异常出现。而经过白藜芦醇中高剂量预处理的实验组QTc较单独应用As2O3实验组QTc明显缩短，显示中高剂量白藜芦醇可作为一种保护As2O3引起的心脏损害的药物。
2002年有研究通过一个大鼠模型说明As2O3的心脏毒性，他们给大鼠静脉注射As2O3[5 mg/（kg·d），30 d，相当于临床用于成人的剂量]，发现As2O3会降低心脏收缩时心室压力升高的速度，同时升高心室舒张末期压力，这种变化经异丙肾上腺素刺激并没有得到改善，经病理证实该现象与明显的心肌细胞坏死有关，进一步研究证实As2O3引起了心肌细胞凋亡，而其可能有caspase-3激活引起。从而开启了人们对As2O3心脏毒性的关注。Saad等[13]报道在连续给予大鼠As2O3[5 mg/（kg·d）]10 d后，发现大鼠血清中CK-MB、GSH-Px、LDH及AST明显升高，心肌组织中还原型GSH含量、GSH-Px活力、MDA及亚硝酸盐明显升高，表明As2O3心脏毒性可能与其过氧化作用有关；而Shi等[2]报道As2O3导致心脏毒性的可能机制为DNA修复和甲基化、活性氧的产生、心肌离子通道的改变和凋亡。Zhao等[14]报道As2O3可减少心肌细胞H9c2的活动度，这种现象呈现浓度依赖性，与心肌细胞的凋亡有关，通过抑制caspase-3激活可减轻心肌细胞凋亡，而caspase-3激活考虑与活性氧的产生及钙超载有关。本实验结果显示As2O3对照组血清CK及LDH升高，而血清中MDA升高，SOD/GSH-Px降低，提示心肌细胞氧化受损在As2O3导致心脏损伤过程中扮演重要的角色。
如何减轻As2O3导致心脏毒性的发生成为目前As2O3临床应用的一大障碍，减轻心脏毒性药物的开发成为目前解决问题的一条途径。Zhao等[15]报道白藜芦醇（3 mg/kg）预处理As2O3给药可明显减轻其心脏毒性。为了探讨白藜芦醇不同剂量对As2O3心脏毒性的保护作用，同时就白藜芦醇在这个过程中的抗氧化作用进行了研究。
白藜芦醇存在于葡萄和酒精中，在植物中，白藜芦醇在遇到外界压力时产生或发挥抗生素的功能，在人体中，白藜芦醇具有抗肿瘤，抗炎、抗血小板及雌激素的功效。现代研究发现，白藜芦醇作为抽提物，成分单一，具有强大的抗氧化作用，可提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂质过氧化，从而保护生物膜。Hung等[16]研究证实，白藜芦醇的抗氧化作用强于维生素E和维生素C，并能清除氧自由基，使DNA免受损伤，还可通过抑制二硫化谷胱甘肽形成，使谷胱甘肽处于还原状态，从而抑制羟自由基的形成。Olas等[17]的报道更进一步说明，白藜芦醇能通过强大的抗氧化活性减轻铂类引起的细胞脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤。本研究结果示：白藜芦醇按15 mg/kg给予时可有效的减弱白藜芦醇导致的大鼠心脏QTc延长，并表现呈剂量依赖性，同时减弱血清CK、LDH的升高，减轻心脏病理结构的损伤，另一方面结果显示白藜芦醇提高SOD/GSH-Px的活力，减弱MDA的生成，提示白藜芦醇预防As2O3所致大鼠心脏毒性与其提高大鼠抗氧化能力有关。已有报道提示：活性氧的生成可激活capase-3，进而引起细胞凋亡，引起心肌细胞的损伤[17]；白藜芦醇通过减弱活性氧的产生，保护心肌细胞线粒体的极性，进而恢复损伤线粒体的功能[19]；Zhao等[15]报道白藜芦醇可减少心肌细胞内自由基生成及降低细胞内钙离子浓度，抑制capase-3的生成，减少心肌细胞凋亡。可见白藜芦醇在保护As2O3所致大鼠心肌细胞损害方面是一个以其抗氧化能力为中心的复杂过程。
为了研究白藜芦醇对As2O3抗肿瘤作用的影响，笔者对二者的抗肿瘤作用进行了研究。结果显示白藜芦醇没有减弱As2O3对A549细胞的抗肿瘤作用，相反白藜芦醇可减弱A549细胞的生长，结果显示二者具有联合作用，同时虽然As2O3及白藜芦醇的血清清除率遵循不同的动力学，但是二者具有相似的半衰期，白藜芦醇的半衰期为（9.2±0.6）h[20]，而As2O3为（12.13±3.31）h[21]，从而减少了二者联合应用时由不同清除动力学导致的限制。因此我们认为白藜芦醇在用来预防As2O3所导致的心脏毒性时，不会减轻其抗肿瘤作用，相反会增加其抗肿瘤作用，为二者联合应用提供了理论基础。
总之，本研究通过动物实验证实白藜芦醇的预防使用可减弱As2O3引起的心肌损伤，其机制可能与白藜芦醇提高机体内抗氧化酶活性有关。同时本实验证实白藜芦醇与As2O3有协同抗肿瘤作用，由此可见，用白藜芦醇预防As2O3的心脏毒性值得临床进一步研究。
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（收稿日期：2013-01-07 本文编辑：卫 轲）