亳芍生物碱提取及含量测定
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摘要：目的 探讨亳芍生物碱提取、定性鉴别及含量测定方法。方法 95%乙醇提取亳芍干粉，总提物回收乙醇后盐酸酸化，二氯甲烷萃取除杂，加氨水中和至弱碱性后氯仿萃取获总生物碱提物，薄层色谱检测，改良碘化铋钾等显色，酸碱滴定法测定总生物碱含量。结果 总生物碱提取物经薄层色谱展开后，改良碘化铋钾显色，可检测到4个橙红色斑点；浓硫酸显色，其中2个斑点呈紫红色；甲醛浓硫酸显色，可见4个紫黑色斑点；以浓硝酸及茚三酮显色未见明显色斑。亳芍总生物碱含量约为0.079%。结论 亳芍中含有生物碱，其中可能包含乌头碱类生物碱。
关键词：亳芍；生物碱；显色反应；酸碱滴定
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）10-0049-03
亳芍（Bozhou Peony Paeonia lactiflora），即亳白芍，主产安徽省亳州地区，为安徽道地药材之一，是毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.或其变种毛果芍药Paeonia trichocarpa栽培品的根，夏秋季采挖，去净泥土和支根，沸水浸或略煮至受热均匀，再经晒干等处理即可。亳芍具有抗炎、免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗惊厥、护肝等作用，对胃肠道疾病和心血管疾病也有一定的疗效[1]。
化学成分研究表明，亳芍主要含有单萜[2]、倍半萜及三萜[3]、单宁[4]、挥发油[5]、黄酮[6]、多酚类[7]、多糖[8]等活性成分，其中，芍药苷（一种单萜类化合物）是亳芍的主要活性成分[2，9-11]。本研究对亳芍生物碱进行提取、定性鉴别及含量测定，为后续的亳芍生物碱分离、结构鉴定及药理学研究奠定基础。
1 仪器与试药
GJ14-DGF3006型电热恒温干燥箱（金坛市荣华仪器制造有限公司），HH-4型数显恒温水浴锅（金坛市国华电器有限公司），LX-02型利祥手提式粉粹机（上海江信科技有限公司），RE-52D型旋转蒸发器（上海浦沪仪器厂），FA-1004型电子天平（上海精科天平厂），TDL-5Z台式多管架自动平衡离心机（湖南星科科学仪器有限公司）。
亳芍购于安徽省亳州药材大市场，经安徽中医学院药用植物标本馆黄和平博士鉴定为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.干燥的根。无水乙醇（扬州沪宝化学试剂有限公司），氨水（扬州沪宝化学试剂有限公司），氯仿（西陇化工股份有限公司），二氯甲烷（西陇化工股份有限公司），甲醇（河北四友卓越科技有限公司），冰醋酸（国药集团化学试剂有限公司），甲醛（无锡市展望化工试剂有限公司），浓硫酸（汕头市西陇化工厂有限公司），次硝酸铋、碘化钾（蚌埠化学试剂厂），浓盐酸（汕头市西陇化工厂有限公司），茚三酮，甲基红，溴甲酚绿，硫酸，氢氧化钠等。
2 方法与结果
2.1 亳芍总生物碱的提取
称取103 ℃烘干至恒重的亳芍粉末25 g，以95%乙醇、料液比1∶4（g/mL）、85 ℃水浴冷凝回流提取3次，每次4 h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至提取液无醇味，加水适当稀释、定容，缓缓加入浓盐酸，使溶液中浓盐酸含量达5%（V/V），摇匀，4000 r/min离心5 min，弃去沉淀，上清液加等体积二氯甲烷萃取3次除杂，分液漏斗移去二氯甲烷层。向下层水相中缓慢滴加氨水至溶液显碱性（10.0≥pH≥8.5，精密pH试纸测定），摇匀，加入等体积氯仿萃取3次，合并氯仿相，减压回收氯仿，得亳芍总生物碱提取物，加氯仿定容100 mL，平均分成2份，分别用于薄层检测和含量测定。
2.2 亳芍生物碱的鉴定
2.2.1 显色剂的配制 ①碘化铋钾显色剂：A.碱式硝酸铋0.85 g溶于10 mL冰醋酸，加水40 mL；B.0.8 g碘化钾溶于20 mL水。试液A与B等量混合，置于棕色瓶内保存，作为储备液。用前将1 mL储备液、2 mL冰醋酸与10 mL水混合均匀即可。②甲醛浓硫酸显色剂：30%甲醛溶液0.2 mL与10 mL浓硫酸均匀混合。③茚三酮显色剂：1.5 g茚三酮+100 mL正丁醇+3.0 mL醋酸，溶解、混匀。
2.2.2 薄层色谱鉴定 按2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法（TLC）试验，3.0 mm点样毛细管吸取“2.1”项下亳芍总生物碱提取物，分别点于5块以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G254薄层板上，以乙酸乙酯-氯仿-甲醇-氨水（8∶2∶3∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，分别以碘化铋钾溶液、浓硫酸、甲醛浓硫酸、浓硝酸、茚三酮溶液显色，检视。结果见表1。
用甲醛浓硫酸显色检测到4个明显的紫黑色显色斑，说明被测样品中含有生物碱；以浓硫酸显色，亳芍总生物碱提取物中可检测到2个明显的紫色显色斑，提示亳芍生物碱包含乌头碱类化合物；浓硝酸显色，未见明显的显色斑，则说明不含秋水仙碱；茚三酮显色未见明显的显色斑，说明被检测到样品中不含氨基酸或短肽类含氮物质。上述结果表明，亳芍中含有生物碱，其中可能包含乌头碱类生物碱。
2.3 亳芍生物碱含量测定
主要参照杨氏[12]方法改进而来。总生物碱含量=C×（V空白-VNaOH）×M÷W×100%。式中，C为滴定用NaOH浓度（本试验中为0.02 mol/L）；VNaOH为滴定加入过量硫酸的生物碱所用NaOH体积；V空白为滴定相同浓度相同体积硫酸所用NaOH体积；M为生物碱的相对生物分子量，本试验选择乌头碱的分子量654.74为代表；W为样品质量（本试验中为25.0 g）。
2.3.1 指示剂的配制 0.1%甲基红乙醇溶液20 mL，加入0.2%溴甲酚绿乙醇溶液30 mL，摇匀，即得。
2.3.2 供试品溶液的制备 精确吸取“2.1”项下亳芍总生物碱溶液10 mL，挥尽氯仿，残渣加无水乙醇3 mL，再加乙醚5 mL，使溶解，即得。
2.3.3 总生物碱含量测定 精密加入0.01 mol/L硫酸10.0 mL，摇匀，置水浴锅上加热，使之充分反应，放置冷却，加蒸馏水15.0 mL和甲基红-溴甲酚绿指示剂2滴，用0.02 mol/L NaOH溶液滴定至淡绿色即得，记录数据；在锥形瓶中精密加入相同浓度相同体积的硫酸溶液（0.01 mol/L硫酸10 mL），加蒸馏水15 mL和甲基红-溴甲酚绿指示剂2滴，用0.02 mol/L NaOH溶液滴定至淡绿色即得，记录数据，作为空白对照。
在本试验条件下，滴定样品消耗的NaOH体积VNaOH=9.40 mL，滴定空白对照消耗NaOH的体积V空白=9.55 mL，则亳芍总生物碱含量=0.02 mol/L×[（9.55 mL-9.40 mL）]÷1000×654.74÷25.0×100%×10≈0.079%。
2.3.4 精密度试验 按“2.3.3”项下方法操作，连续测定5次，结果表明，以乌头碱计，5次测定的亳芍中总生物碱含量的RSD=1.95%，表明本方法精密度良好。
2.3.5 重复性试验 取同一批次亳芍样品粉末，称取6份，每份约25 g，精密称定，按样品处理方法操作。结果RSD=2.1%，表明符合要求。
2.3.6 稳定性试验 精密吸取“2.1”项下制备的总亳芍生物碱溶液，分别于0、12、24、36、48、60 h测定总生物碱，结果总生物碱含量RSD=2.43%，表明供试品溶液在60 h内基本稳定。
3 讨论
本试验结果表明，亳芍中含有生物碱，其中可能包含乌头碱类生物碱。本试验结果为研究亳芍及其复方的药效物质基础、探讨亳芍药理活性提供了新的思路，也为获得天然来源的生物碱提供了新的基源植物。
碘化铋钾是鉴定生物碱最常用的显色剂，与生物碱反应显橙红色。在本试验条件下，采用碘化铋钾显色，亳芍总生物碱检测到4个明显的橙红色显色斑，说明亳芍中含有生物碱。某些含氮非生物碱物质如氨基酸等遇到碘化铋钾也会显色。为此，试验选择了浓硫酸、甲醛浓硫酸、浓硝酸和茚三酮等常用显色剂及紫外检测对亳芍总生物碱进一步显色鉴定加以验证。
酸碱滴定法是测定生物碱含量的经典方法，虽然此法的灵敏度较低，但操作简便，成本低廉，且准确性、稳定性均较好[13]。在本试验条件下，测得生物碱的含量约为0.079%，远低于芍药苷的3.5%。因此，从含量角度考虑，生物碱可能不是亳芍的主要活性成分。
参考文献：
[1] Jia N， Shu QY， Wang LS， et al. Analysis of petal anthocyanins to investigate coloration mechanism in herbaceous peony cultivars[J].
Sci Hortic，2008，117（2）：167-173.
[2] Braca A， Kiem PV， Yen PH， et al. New monoterpene glycosides from Paeonia lactiflora[J]. Fitoterapia，2008，79（2）：117-120.
[3] Wang HB， Gu WF， Chu WJ， et al. Monoterpene glucosides from Paeonia lactiflora[J]. J Nat Prod，2009，72（7）：1321-1324.
[4] Ikuta A， Kamiya K， Satake T， et al. Triterpenoids from callus tissue cultures of Paeonia species[J]. Phytochemistry，1995， 38（5）：1203-1207.
[5] Kamiya K， Yoshioka K， Saiki Y， et al. Triterpenoids and flavonoids from Paeonia lactiflora[J]. Phytochemistry，1997， 44（1）：141-144.
[6] Tanaka T， Fukumori M， Ochi T， et al. Paeonianins A-E， new dimeric and monomeric ellagitannins from the fruits of Paeonia lactiflora[J]. J Nat Prod，2003，66（6）：759-763.
[7] Guo D， Ye G， Guo H. A new phenolic glycoside from Paeonia lactiflora[J]. Fitoterapia，2006，77（7/8）：613-614.
[8] Tomoda M， Matsumoto K， Shimizu N， et al. An acidic polysaccharide with immunological activities from the root of Paeonia lactiflora[J]. Biol Pharm Bull，1994，17（9）：1161-1164.
[9] Chen F， Lu HT， Jiang Y. Purification of paeoniflorin from Paeonia lactiflora Pall. by high-speed counter-current chromatography[J]. J Chromatogr A，2004，1040（2）：205-208.
[10] Lee B， Shin YW， Bae EA， et al. Antiallergic effect of the root of Paeonia lactiflora and its constituents paeoniflorin and paeonol[J]. Arch Pharm Res，2008，31（4）：445-450.
[11] Xiao L， Wang YZ， Liu J， et al. Effects of paeoniflorin on the cerebral infarction， behavioral and cognitive impairments at the chronic stage of transient middle cerebral artery occlusion in rats[J]. Life Sci，2005，784（12）：413-420.
[12] 杨云，王浴铭，赵晓华.附子中乌头生物碱定量方法的研究[J].时珍国医国药，1998，9（4）：331-331.
[13] 何军，祝林，秦建芳.附子总生物碱含量测定方法比较[J].现代中药研究与实践，2003，17（6）：20-22.
（收稿日期：2013-04-04，编辑：陈静）