自身γδT细胞治疗乙型肝炎的临床观察
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇自身γδT细胞治疗乙型肝炎的临床观察范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
[摘要] 目的 观察γδT细胞和HepG212115细胞共培养后对其HBV复制和HBeAg表达的影响。评估用γδT细胞过继回输治疗乙型肝炎的疗效。 方法 在体外用异戊希焦磷酸法和IL-2激活人外周血PBMCs，细胞经10 d培养后用流式细胞术检测培养前后γδT细胞含量和Perforin、GranB、NKG2D表达量；将γδT细胞与HepG212115细胞按一定比例共孵育培养后，ELISA法测定上清中HBeAg的表达。将培养10 d的γδT细胞回输给患者；患者一个疗程接受γδT细胞总数在0.8×1010～7.0×1010。 结果 培养10 d时γδT细胞数为91.27%，其细胞表达的Perforin、GranB、NKG2D分别为和62.8%、72.7%和60.8%。所扩增的γδT细胞能够部分抑制HepG212115细胞中HBeAg的表达。治疗前138例HBeAg阳性者，治疗后有76例HBeAg（55.1%）转阴。总有效率为77.51%。 结论 γδT细胞能够降低HepG212115细胞中HBeAg表达；用自身γδT细胞过继回输治疗乙型肝炎后患者的HBeAg+HBV- DNA 转阴率达74%。该治疗无毒副作用，对乙型肝炎是一种安全有效的治疗方法。
[关键词] 异戊烯焦磷酸单酯；乙型肝炎；γδT细胞；HepG212115细胞；免疫治疗
[中图分类号] R512.62 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（c）-0027-04
目前抗乙型肝炎病毒的治疗一般采用核苷类似物或/和IFN–α联合治疗，虽然具有一定的临床疗效，但均难以彻底清除病毒。随着对抗病毒细胞免疫学与分子生物学的深入研究和对乙型肝炎发病机理的研究阐明，细胞免疫治疗正在成为乙型肝炎治疗的一种重要手段。γδT细胞是一种较新型的肿瘤效应细胞，国内外许多研究证实，人外周血中培养的γδΤ细胞具有较强的抗肿瘤效应，但目前对其应用于慢性乙型肝炎临床治疗的报道较少。Poccia等[1]报道，γδT细胞在早期的抗病毒免疫应答过程中发挥重要的作用。由于γδT细胞仅占外周血淋巴细胞总数的1%～5%，限制了其临床应用研究。本研究应用患者自身外周血单个核细胞（PBMC）在体外用异戊希焦磷酸法刺激PBMCs来特异性扩增γδT细胞，然后将培养成功的细胞回输给乙型肝炎病毒（HBV）感染患者，通过近期和中长期的随访来观察治疗效果。
1 对象与方法
1.1 对象
1.1.1 研究对象 按1995年全国病毒性肝炎诊断标准，选择160例在第九七医院于2005年1月～2012年6月住院与门诊病人，其中慢性乙型肝炎89例，乙型肝炎病毒携带者71例。女64例，男96例，年龄18～59岁。160例中138例HBV-DNA和HBeAg均阳性，22例仅为 HBV-DNA阳性；所有患者1年内均未行抗病毒治疗。治疗之前均明确告知本治疗的优点和不足，患者或家属签署知情者同意书，并报医院伦理委员会批准。
1.1.2 试剂 rhIL-2（比活性40 U/ng）（Promega公司）；RPMI1640、胎牛血清（Gibico公司）；淋巴细胞分离（Ficoll，1.077）（上海第二制药厂）；HBeAg酶免检测试剂盒（山东3V）；乙肝病毒核酸扩增PCR荧光检测试剂盒（深圳匹基生物工程股份有限公司）。荧光标记的单抗和同型对照抗体FITC-mIgGI、PE-mIgF2a（DB公司和PHarmingen公司）；FITC标记的Anti-TCR-γδ、PE标记的穿孔素（Perforin）、颗粒酶B（GranB）、NKG2D及Fix&Perm破膜剂（购自ebioscience公司）；IPP（Sigma公司）。HepG212115细胞购于上海细胞所本室传代保存。流式细胞仪（美国B.D公司的FACSCaliar，分析软件为ELITE），Rochelightcycler荧光PCR检测仪（瑞士罗氏公司）。
1.2 方法
1.2.1 γδT细胞的培养和鉴定 用Baxter CS-3000血细胞分离机分离患者PBMC，采集血液总量4 000～5 000 mL，获取的PBMC（含有部分红细胞）数为2.0×109～4.5×109，在进行PBMC采集时留取100 mL自身血浆在细胞回输时应用。将采集的PBMC分离出部分血浆应用于自身细胞培养，其他细胞悬液用淋巴细胞分离液分离，以1500 r/min离心10 min、离心半径15 cm，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤3次（1500 r/min离心，10 min/次、离心半径15 cm），将细胞用无血清培养基配成1×109/L的细胞悬液（含3%人自身血清、IL-2 1×105 U/L和IPP 3 mg/L），加入GT-T503细胞培养袋（2000 mL/袋）内。收集培养10 d的细胞进行抗人TCR-γδ-FITC表面标志检测。用于治疗的γδT细胞进行细菌和霉菌培养，阴性后收集细胞，用生理盐水洗涤3次，悬浮于自身血浆中供静脉回输。疗程终细胞数3.1×109～1.0×1010。
1.2.2 γδT细胞与HepG212115细胞混合培养 将HepG 212115复苏后本实验室传代扩增，收集细胞配成密度为1×108/L的细胞悬液 按每孔0.5 mL接种于48孔细胞培养板中，分别加入培养10 d，百分率大于80%的γδT细胞，使其与HepG212115细胞的比例分别为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1和40∶1；各组用含10%胎牛血清和3%AB血清的RPMI1640补充至1 mL。每测试点设5个复孔。培养72 h后收集培养上清液0.4 mL，用于HBeAg检测。
1.2.3 HBeAg和HBV-DNA测定 各项操作步骤按试剂盒说明书进行，HBV-DNA含量用PCR检测度；HbeAg用酶免治疗检测，结果以测定孔吸光度值/阴性孔吸光度值（P/N）表示。抑制率按下列公式计算： 抑制率（%）=（对照孔P/N值-实验孔P/N值对照孔P/N值）×100%。
1.2.4 FCM法检测 培养前后γδT细胞的PFP，GraB，NKG2D 收集培养前的PBMC和培养10 d的γδT细胞经PBS洗1次，用pH 7.4 PBS调整细胞密度为1×1010/L。①GraB和perforin检测：在上述处理好的细胞中每管加入TCR-γδ-FITC抗体 20 μL，避光孵育30 min后分别加入100 μL anti-GraB-PE和anti-PFP-PE。室温避光孵育15 min，每管加3 mL PBS洗涤，1500 r/min 离心5 min，弃上清。0.5 mL PBS重悬细胞，上机检测。②NKG2D的检测：取上述配制好细胞悬液各100 μL，加入100 μL破膜液破膜，加入TCR-γδ-FITC抗体 20 μL，避光孵育30 min后分别加入100 μL anti-NKG2D-PE，室温孵育20 min。PBS 2 mL洗涤，2000 r/min离心5 min，弃上清，0.5 mL PBS重悬细胞，上机检测。
1.2.5 细胞因子的检测 收集不同培养时间的γδT细胞，1500 r/min×6 min， RPMC1640洗1次。调整细胞密度为5×109/L，接种24孔细胞培养板，每孔2 mL，于37℃、50 mL/L CO2环境继续用γδT细胞培养液培养48 h后收集细胞，1500 r/min×6 min，各取上清液0.5 mL，用酶免法检测上清液中的IL-10、IL-12、INF-γ和TNF-α含量。操作过程严格按照说明书进行。每检测样本设5个复管，取平均值。
1.3 治疗方案
每周回输γδT细胞2次，连续治疗8～12次为1个疗程，回输细胞总数为3.1×1010～9.0×1010。除少数患者病情有反复者6个月后进行第2次疗程外，其他患者均在12个月后行第2次治疗。160例患者中接受1个疗程治疗有81例，2个疗程治疗45例，3个疗程治疗有15例，4个疗程以上有19例。
1.4 观察指标
治疗前后及随访时检查HBV-DNA、HBeAg和肝功能。
1.5 疗效判断
根据HBeAg与HBV-DNA结果进行疗效评估，显效：HBeAg与HBV-DNA均转阴；有效：HBeAg与HBV-DNA有一项转阴；无效：HBeAg与HBV- DNA无变化。
1.6 统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行数据处理，数据以均值±标准差（x±s）表示。组与组之间的比较采用独立样本t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 γδT细胞培养和鉴定
PBMC在γδΤ细胞培养液中培养24 h即可见细胞集落生长，每个集落约2～3个细胞，72 h后集落开始变大，培养10 d可见大的集落和部分散在生长细胞。培养10 d的γδΤ细胞涂片行瑞姬染色可见细胞体积大，呈椭圆或不规则形，细胞核大多为椭园或园形，核染质疏松，核膜不规则，有凸起；胞质丰富，染成灰兰色，形态不规则。收集培养前的PBMC和培养10 d的γδT细胞进行流式细胞检测，结果见图1、2。培养前γδT细胞数为3.12%，培养10 d时γδT细胞数为90.46%。
2.2 γδT细胞对HepG212115 细胞中的HBeAg表达的影响 γδT细胞分别以1∶1、5∶1、10∶1、20∶1和40∶1的比值与HepG212115细胞共培养72 h。结果显示，2种细胞共培养后对HepG212115 细胞中的HBeAg的表达有显著的抑制作用。随细胞比值增加，抑制率逐渐增强。见图3。
2.3 PBMC培养前后γδT细胞穿孔素、粒酶B和NKG2D结果
不同培养时间γδT细胞穿孔素、粒酶B和NKG2D结果有明显差异。培养8d的γδT细胞穿孔素、粒酶B和NKG2D分别为62.8%、72.7%和60.8%，显著高于培养前的PBMC（分别为0.18%、1.10%和1.30%）。结果见表1和图4、5。
2.4 不同培养时间细胞培养上清中细胞因子结果
不同培养时间的γδT细胞所分泌的细胞因子结果见表2。四种细胞因子结果在各培养时间段有一定的差异，IFN-γ和TNF-α含量在培养9 d时高于其他组，组间比较有统计学意义（P < 0.05）。IL-10和IL-12分泌量各组间差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.5 治疗后血清中HBeAg和HBV-DNA转阴情况
治疗前138例HBeAg阳性者，治疗后有76例HBeAg（55.10%）转阴。160例HBV-DNA阳性者治疗后有82例转阴，转阴率为51.25%。按疗效判断标准，显效51.88%（83/160），有效25.63%（41/160），无效20.85%（26/160），总有效率为77.51%。
2.6 随访结果
经3个月～5年随访，HBeAg转阴者由治疗结束时的76例增至87例，转阴率为60.0%（96/160），HBV-DNA转阴者由82例增至112例，转阴率为70.0%（112/160）。
2.7 毒副反应
21例在回输后出现低热，经对症处理后24 h降至正常。
3 讨论
乙肝病毒的持续感染是造成乙肝慢性化的主要原因，且可导致病情发展、恶化至肝硬化和HBV相关性肝细胞癌。由于慢性乙肝病毒感染者的机体免疫状态失衡，机体免疫系统对抗病毒产生耐受。因此，抗病毒治疗是慢性乙肝治疗的关键。国内在对乙肝发病机制的研究中发现，宿主免疫细胞数量减少或功能低下、不能有效清除病毒是导致乙肝慢性化的重要原因之一[3]。当前各种药物和治疗方法均不能有效清除已经整合到肝细胞内的乙肝病毒。随着细胞免疫学和分子生物学对乙肝发生发展机制的阐明，发现细胞免疫在机体抗病毒感染免疫中占主导地位，起着重要的作用。因此，提高机体的T 淋巴细胞和抗原提呈细胞的细胞免疫功能及增加协同细胞因子等多种方法联合对于清除病毒、打破免疫耐受将起到重要的作用。
γδT细胞是广泛分布于黏膜上皮组织内的固有免疫T细胞，它的抗肿瘤效应除了有与αβT细胞类似的一些功能特征外，γδT细胞能够以MHC分子非限制的方式识别磷酸化的小分子抗原如IPP、热休克蛋白等，活化后表达CD80、CD86等协同刺激分子，可参与抗原递呈，替代树突状细胞的功能[4-5]，γδT细胞识别多肽抗原时无MHC限制，而且还能识别一些非多肽抗原[6-7]。γδT细胞是一种固有免疫效应细胞，有研究发现，活化的γδT细胞具有抗感染、抗肿瘤作用[8-10]。γδT细胞还可以维持免疫耐受，调节免疫应答，参与自身免疫性疾病的发生。尽管γδT细胞在人外周血中数量较少，但却具有的重要免疫学功能。目前有许多用人外周血中培养的γδΤ细胞进行抗肿瘤细胞报道[11-13]，但应用于慢性乙型肝炎临床治疗的研究少见报道。我们在前期进行的小样本病例试治的基础上[3]，进行了大综病例的临床治疗，取得了一定疗效。
Yin等[13]实验结果表明，γδT细胞还能够分泌多种细胞因子，在培养的上清液中细胞因子IFN-γ分泌明显增高，这与我们的实验结果相似。另外，我在体外实验中发现，γδT细胞和HepG212115细胞混合培养后， 对HepG2 12115 细胞中的HBeAg的表达有显著的抑制作用[7]，并随着诱导的细胞比值增加和时间延长，抑制率逐渐增加，且高浓度比低浓度作用更为明显。不同密度的γδT细胞与HepG212115细胞混合培养后上清液中HBV-DNA也有较为显著的下降，最多能下降约2个对数值，以上结果与Sells等[14]报告的一致。这些研究说明，γδT细胞能够有效的抑制HBV-DNA的复制及HBeAg的表达，发挥抗病毒效应。笔者用体外培养的的自身γδT细胞回输治疗HBV感染者也取得了一定的临床疗效，进行治疗的160例HBV感染者治疗后血清HBV-DNA转阴者由82例增至112例，转阴率为70.0%（112/160），HBeAg转阴率为60.0%（96/160），治疗后总有效率为77.51%。
应用γδT细胞治疗慢性乙型肝炎的确切机理尚不清楚，可能与下列内容有关：①γδT细胞对细菌和病毒感染的细胞能快速应答且不需抗原提呈，且无MHC限制性。因此，取患者自身PBMC经体外激活和扩增然后回输给患者可以直接杀伤被乙型肝炎病毒感染的靶细胞。②γδT细胞可能分泌多种细胞因子，尤其是γ-INF在抗病毒的合成具有重要作用，另外还能分泌GM-CSF和TNF等细胞因子，这些细胞因子能抑制病毒的复制[14-16]，本研究培养的γδT细胞分泌IFN-γ和TNF量明显高于培养前。③乙型肝炎感染患者的PBMC经IPP和IL-2活化和扩增后的γδT细胞高表达穿孔素、粒酶B和NKG2D，因为穿孔素、颗粒酶B是杀伤性T淋巴细胞中的主要活性物质，与T细胞活化以后脱颗粒过程相关，其比值可以直接反应该效应细胞具有的特异性杀伤活性。γδTCR刺激物（如甲羟戊酸途径代谢物IPP）刺激后γδT细胞的NKG2D表达与NKG2D相关的调脂蛋白A/B及Toll样受体及效应细胞相关的受体有关，如MHC A、B，MHCⅠb和F1-AYP合酶以及黏附分子如ICAM-1等的表达水平密切相关[17]。
有关过继性免疫治疗尚无统一方案。笔者认为回输细胞总数应>1×1010可能才能具有治疗作用。将γδT细胞回输治疗与其他药物应用相结合，增加细胞和某些细胞因子（如干扰素、IL-2）用量及某些药物如核苷类似物等联合应用可能会取得更好效果。从本实验结果表明，用γδT细胞治疗慢性乙肝具有一定的应用前景。
[参考文献]
[1] Poccia F，Agrati C，Martini F，et al. Antiviral reactivities of gamma delta T cells[J]. Microbes Infect，2005，7（3）：518-528.
[2] 陈复兴，刘军权，冯霞，等.一种体外扩增一种体外扩增人γδT细胞的新方法[J].细胞与分子免疫学杂志，2007，23（7）：662-664.
[3] 刘军权，陈复兴，朱云，等.自身γδT 细胞的体外培养鉴定和治疗慢性乙型肝炎的临床观察[J].实用肝脏病杂志，2009，12（6）：420-426.
[4] Viey E，Fromont G，Esudier B，et al. Phosphostim-activated gamma delta T cells kill autologous metastatic renal cell carcinoma [J]. Journal of Immunology，2005，174：1338-1347.
[5] Corvaisier M， Moreau-Aubry A，Diez E，et al. V gamma 9V delta 2 T cell response to colon carcinoma cells [J]. J Jmnunol，2005，179：5481-5488.
[6] Brandes M，Moser B. γδT cells： an alternative type of professional APC[J]. Trends in Immunology，2006，27（3）：112-118.
[7] Born WK，Reardon CL，Brien RL. The function of γδT cells in innate immunity [J]. Current opinion Immunology，2006，18（1）：31-38.
[8] Campillo JA，Martinez-Escribano JA，Minguela A，et al. Increased number of cytotoxic CD3+CD28- gammadelta T cells in peripheral blood of patients with cutaneous malignant melanoma[J]. Dermatology. 2007，214（4）：283-288.
[9] 刘军权，陈复兴，朱斌，等.吡罗西康对人γδT细胞和消化系统肿瘤细胞的作用比较[J].陕西医学杂志，2008，37（9）：1107-1111.
[10] 刘军权，陈复兴，巩新建，等.自身γδT细胞联合阿司匹林治疗晚期胃癌的实验研究和临床疗效观察[J].医学研究杂志，2009，38（12）：32-36.
[11] 朱月华，刘军权，曹卉，等.放疗联合自身免疫细胞治疗宫颈癌的临床疗效[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2012，19（4）：421-427.
[12] 朱云，刘军权，张南征，等.结直肠癌患者化疗联合自体多种免疫细胞治疗疗效观察[J].徐州医学院学报，2011，31（9）：623-629.
[13] Yin，Zhang DH，Welte T，et al. Dominance of IL-12over IL-4 in gamma delta T cell differentiation leads to default production of IFN Gamma： failure to down-regulate IL-12 receptor beta 2-chain expression[J]. Immunol，2000，164：3056-3064.
[14] Sells MA，Chen ML，ACS G. Production of hepatitis B virus parti2 cles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1987，84（4）：1005-1009.
[15] Ngom PT， Solon J， Moore SE，et al. Thymic function and T cell parameters in a natural human experimental model of seasonal infectious diseases and nutritional burden [J]. J Biomed Sci，2011，18（41）：18-41.
[16] Chen M，Hu P，Peng H，et al. Enhanced peripheral γδT cells cytotoxicity potential in patients with HBV-associated acute-on-chronic liver failure might contribute to the disease progression [J]. J Clin Immunol. 2012，32（4）：877-885.
[17] Corvaisier M，Moreau-Aubry A，Diez E，et al. γ9δ2 Τ cell response to colon carcinoma cells [J]. J Jmmunol，2005，179：5481-5488.
（收稿日期：2013-06-03 本文编辑：卫 轲）