胰腺组织单细胞悬液制备方法的比较研究
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作者：张召辉 李 玺 夏安周 路逵阳 陈复兴
【关键词】 胰腺
摘 要：目的：寻找更好的胰腺组织单细胞悬液制备方法。方法：以大鼠冷缺血胰腺组织作为标本，分别采用剪碎和研磨法制备胰腺组织悬液。经台盼蓝染色测细胞存活率，并进行流式细胞术分析。结果：剪碎法细胞形态较完整、存活率高；两种方法细胞凋亡水平（APO）、CV值有显著性差异（P <0.01）。结论：胰腺组织单细胞悬液制备剪碎法优于研磨法。
关键词： 单细胞悬液； 胰 腺； 流式细胞术
Comparative Study of two Methods for Making Pancreatic Tissue into Single Cell Suspension
Abstract：Objective： To explore the mechanical methods for making pancreatic tissue into single cell suspension. Method： All of the samples for this experiment were collected from pancreas of rat with post cold ischemic injury . Single cell suspension got by “cut” and “homogenator” way were detected with FCM（Flow cytometry）. The cell viability was assessed by typan blue exclusion；The morphologic changes of cell were observed. Result： Cells got by the method of “cut” were intact，the viability was good，the percentage of APO and CV vales were low. Conclusion： The method of“cut”with sissors for making renal tissue into single cell suspension was better than that of“homogenator”.
Key words： Single cell suspension； Pancreas； Flow cytometry
流式细胞术（Flow cytometry ，FCM）是近年来发展起来的一种细胞的分析新技术，具有快速、精确、高灵敏、多参数等特点［1］。在这项技术中，细胞的分析检测均以单个细胞为基础，因此单细胞悬液样品的制备是关键的环节，细胞数量不足、细胞粘连成块、样品中杂质碎片过多均可造成分析失败，而实体组织的单细胞悬液制备尤为困难。本实验采用剪碎法和研磨法制备新鲜胰腺实体组织单细胞悬液，旨在通过胰腺细胞活力测定，流式细胞术分析比较两种方法优劣。
1 材料和方法
1.1 试剂与仪器：FACS Calibur型流式细胞仪（美国B.D公司）；XD-101倒置显微镜（江南制造厂）；台盼蓝和碘化丙啶（均为Sigma公司）。
1.2 测定标本：10只Sprague-Dawley(SD) 大鼠，雌雄兼用，由徐州医学院实验中心提供，按文献的方法［2］制备成胰腺冷缺血模型，切取胰腺组织，检测各项指标。
1.3 单细胞悬液的制备：在无菌条件下，取胰腺放入平皿中，用磷酸缓冲液（PBS）除去胰腺组织表面的血液及血凝块，从同一大鼠胰腺取大小约0.5 cm3两新鲜组织块，分别用剪碎和研磨2种方法制备组织悬液。
1.3.1 剪碎法：将组织块放入平皿后，加入少量PBS；用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入10 ml PBS；用吸管吸取组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管内；离心沉淀1500 prm×3 min，再用PBS洗3次，每次以500 prm短时低速离心除去细胞碎片，以300目尼龙网过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×106 /ml。常温下放置, 待测细胞的活力。
1.3.2 匀浆器法：用眼科剪将组织剪成小块；放入70 ml组织研磨器内，加入2 ml PBS；缓慢转动研棒，研磨至匀浆；用10 ml PBS冲洗研器；收集细胞悬液，经300目尼龙网过滤；离心沉淀800 prm×2 min ，再用PBS洗3次，离心沉淀。以下处理同剪碎法。
1.4 形态学观察及细胞活性测定：取制备好的胰腺细胞悬液，在相差倒置显微镜下观察其形态学变化；取9滴各组细胞悬液,加一滴台盼蓝溶液混匀后，于4℃冰箱静置20 min，用血小板记数板在光镜下分别记数活细胞和死细胞。
1.5 荧光染色：取细胞悬液，用70%预冷乙醇固定过夜，然后用4℃ PBS洗涤2次。加入0.5 ml PBS悬浮细胞，再加入50 μg/ml 碘化丙啶染色，4℃避光染色，过200目尼龙网，上FCM检测。应用CellQuest软件自动获取10000细胞/样品，ModFit LT软件进行DNA含量分析。主要检测指标：细胞凋亡水平（APO）、G0/G1细胞比率、DNA指数（DNA index，DI）、S期细胞比率（SPF）、CV值。
1.6 统计学处理：所有数据用均数±标准差（ ± s）表示，采用配对t检验做差异显著性分析。
2 结 果
2.1 细胞形态：在相差倒置显微镜下观察，剪碎法所得的胰腺细胞形态完整、分散度好、背景较干净、杂质少，而研磨法视野中有较多的细胞碎片，完整细胞相对较少。台盼蓝排斥实验分别检测两种分离方法所得细胞存活率，剪碎法平均为78%，研磨法则为52%。
2.2 FCM检测结果：从DNA直方图上可见，匀浆法图形比剪碎法的图形差，表现为G1峰明显加宽，G1峰前出现较宽的碎片峰。DNA含量各参数的对比（表1）：2种方法G0/G1细胞比率、DI、SPF无显著性差异（P >0.05），而细胞凋亡水平、CV值匀浆法明显高于剪碎法（P <0.01），见表1。
表1 不同制备法对细胞APO、DI、G0/G1、S和CV值的影响（ 略 ）
3 讨 论
流式细胞术是近年来发展起来的一种细胞的分析新技术，广泛应用细胞凋亡等方面的研究，具有快速、精确、高灵敏、多参数等特点。而单细胞悬液的制备又是进行流式细胞术分析的关键环节，尤其在实体组织分散细胞悬液的制备方面，还有很多问题有待解决，至今尚无一个合适通用的方法。采用何种方法能够获得产率高、活性高、功能强的单细胞，对于进一步的实验研究十分必要。因此，可根据具体的实验目的及不同的组织特点选择合适有效的单细胞悬液的制备方法。目前实体组织细胞悬液制备方法主要有机械法和酶消化法两种，由于胰腺组织中含有较多的纤维组织，本实验在预实验阶段曾采用先加纤溶酶再加胰蛋白酶的酶消化法，但均未获得足够细胞浓度的单细胞悬液（＜1×106），这可能与胰腺腺泡细胞中含有大量的消化酶有关。机械法主要给予组织较大的压力，使细胞从组织间释放出来。本实验比较两种制备胰腺细胞悬液的方法，镜下观察剪碎法细胞形态较完整，背景干净，杂质少，细胞存活率高；匀浆法制备的细胞悬液的DNA直方图质量较差，主峰较宽，主峰前杂乱信号较多；DNA参数分析，剪碎法细胞凋亡水平、CV值明显低于研磨法，而DI、SPF、G0/G1细胞比率无显著性差异。机械法中研磨法与剪碎法相比，研磨过程中更易损伤较多的细胞，因而易造成胰腺细胞死亡，完整细胞相对较少，细胞存活率较低。研磨过程中受损破坏的细胞及细胞碎片PI染色后均可发生低荧光，显示在凋亡峰位置，出现一定假阳性，导致APO检出率较高。CV值包括两部分，一是使用标准品测得的仪器CV值与实验样品所测得的CV值之和，CV值越小则曲线分布越窄、越集中，测量误差越小。本实验显示，两种方法的CV值有明显差异，剪碎法样品的CV值显著低于研磨法。综合以上分析，我们认为酶消化法费时且较难获得足够浓度的单细胞悬液，机械法中，剪碎法制备胰腺组织悬液，不仅比研磨法简便，而且细胞存活率高、检测准确性更好。因此，胰腺组织细胞悬液制备剪碎法优于研磨法。
参考文献：
［1］ 马文新.流式细胞仪技术与原理［J］.世界医疗器械，1998，4（4）：28.
［2］ 张召辉，李玺，路逵阳等．大鼠胰十二指肠移植模型的建立［J］.徐州医学院学报，2003，23(3)：205-206．