印第安刺猬蛋白信号通路與颞下颌关节改建间的关系
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【摘要】印第安刺猬蛋白（Ihh）属刺猬蛋白家族成员，参與调节胚胎发育和器官形成。Ihh通过调控其受体碎片蛋白和平滑蛋白以及下游的锌指转录因子Gli等不但维持着颞下颌关节胚胎期的正常发育，而且在脊椎动物或非脊椎动物出生后的下颌髁突和关节盘的生长改建中也起着重要的作用。本文就Ihh信号通路、Ihh参與软骨内成骨的分子生物学机制、Ihh对颞下颌关节生长发育的调控和Ihh对颞下颌关节的生物力作用等研究进展作一综述。
【关键词】印第安刺猬蛋白；软骨细胞；成骨细胞；颞下颌关节
【中图分类号】Q51
【文献标志码】A
刺猬蛋白系其基因突变的果蝇胚胎呈多毛团状，酷似受惊的刺猬而得此名。刺猬蛋白信号通路广泛参與细胞的生长與分化调节，在脊椎动物和非脊椎动物的胚胎发育和维持成熟组织的稳态中起着非常重要的调控作用。在高等脊椎动物中，刺猬蛋白家族成员至少包含声音刺猬蛋白（sonic hedgehog，Shh）、荒漠刺猬蛋白（desert hed-gehog，Dhh）和印第安刺猬蛋白（Indian hedgehog，Ihh）三个家族成员。Ihh精确地调控软骨内成骨的不同阶段，包括软骨细胞的增殖和分化以及软骨膜处间充质细胞向成骨细胞的分化。Ihh过表达可促进软骨细胞向肥大软骨细胞的分化，Ihh+突变型小鼠则导致骨发育不良的短小畸形、软骨形成障碍和骨发生不足的颅面部畸形。Ihh不仅维持着颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）的胚胎发育，而且在脊椎动物或非脊椎动物出生后的下颌髁突和关节盘的生长改建中也起着重要的作用。
1 Ihh信号通路
Ihh信号通过细胞膜上的跨膜受体碎片蛋白（patched，PTC）和平滑蛋白（smoothened，SMO）来调控下游锌指转录因子Gli等的转录。
1.1碎片蛋白
PTC是由肿瘤抑制基因PTC编码的一类12通道的单一肽链结构的跨膜蛋白质。人类的2个PTC同源基因PTC1和PTC2分别编码PTC1和PTC2蛋白。生理状态下，PTC抑制SMO信号传导，使SMO处于转录抑制状态；然而当位于细胞膜表面的PTC與Ihh结合后，SMO所受的抑制被解除，使SMO处于激活状态。
1.2平滑蛋白
SMO是由原癌基因SMO编码的一类7通道单一肽链结构的跨膜蛋白质，属于G－蛋白偶联的多通道膜蛋白质，其N端位于细胞外，C端位于细胞内，跨膜区氨基酸序列高度保守，C末端的丝氨酸與苏氨酸残基为磷酸化部位，蛋白激酶催化时结合磷酸基团。SMO磷酸化水平影响着细胞质内其他相关后续分子的磷酸化反应，从而改变核转录因子的活性状态。
1.3Gli蛋白
在脊椎动物中，SMO的靶点相关蛋白有Gli-1、Gli-2和Gli-3。在Gli结合DNA的结构域中含有较多的半胱氨酸和组氨酸区域，借肽链的弯曲與一个锌离子络合成锌指结构，它还含有一个细胞质固定域，可與其他细胞质蛋白相互作用。Gli是Ihh信号通路中的关键因子，它可以启动或抑制其下游靶基因。生理情况下，PTC抑制着SMO的活性，从而抑制下游通路，这时下游Ihh信号终端传递者Gli蛋白在蛋白酶体内被截断，通过遍在蛋白（旧称泛素）水解途径降解成相对分子质量为7.5×104的片段，并以C末端被截断的形式进入细胞核内，抑制下游靶基因的转录。
当PTC與Ihh结合以后即解除对SMO的抑制作用，促使Gli蛋白與蛋白激酶A以及丝氨酸／苏氨酸激酶（fused，Fu）、Fu抑制因子（FuSu）、Costal-2（Cos-2）與微管形成大分子复合物，使得全长Gli蛋白进入核内，成为转录激活子，引起该通路下游基因的转录激活，从而发挥调节软骨细胞的增殖和分化作用。Gli-1與Gli-2在蛋白质水平的作用相似，主要是激活Ihh信号转录，而Gli-3的主要功能则是通过蛋白质水解过程作为转录的抑制因子。在骨的生长发育过程中，Ihh作用的充分发挥主要取决于Gli-2的转录激活和Gli-3的转录抑制；而且在Gli-3缺失的情况下，Gli-2的转录激活足以调控Ihh介导的成骨细胞分化作用。上述Ihh信号通路可由拮抗剂环巴胺（cyclopamine，一种植物性甾体类生物碱）通过與膜受体SMO的相互作用而被特异性抑制。
2 Ihh参與软骨内成骨的分子生物学机制
Ihh由前肥大软骨细胞和肥大软骨细胞分泌，可调节软骨细胞的增殖和分化，还可以作用于软骨膜处的间充质干细胞，刺激其向成骨细胞的分化。由此可见，Ihh参與了软骨内成骨过程中的软骨形成和骨形成。
2.1调控软骨细胞的增殖
细胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）可以通过促进G1／S期的转换加快细胞周期进程。Ihh促进软骨细胞增殖是通过调节细胞周期来实现的。在敲除Ihh或Smo基因的小鼠模型中，软骨细胞增殖率下降的同时伴随着CCND1的表达下调。即CCND1参與介导Ihh对软骨细胞增殖的调控。
2.2调控软骨细胞分化速率
甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormone related protein，PTHrP）属于甲状旁腺素家族，主要表达于增殖的软骨细胞和肥大软骨细胞之间，可保持软骨细胞增殖和延迟软骨细胞分化和程序性死亡，促进髁突生长发育。Ihh可促进PTHrP的表达，同时PTHrP也可通过自分泌或旁分泌细胞内因子激活其受体保持细胞增殖，降低有增殖潜能的软骨细胞向肥大的软骨细胞转化，因而抑制软骨细胞的终末分化。当PTHrP不足以刺激软骨细胞增殖时，软骨细胞开始分泌Ihh，从而反馈性上调PTHrP的表达水平，该反馈环路协调软骨细胞的增殖和成熟。
在Pthrp+的小鼠前肢组织体外培养当中激活Ihh的表达，可加速软骨细胞的成熟和肥大；相反，当用环巴胺或敲除Smo时，Pthrp表达缺陷的软骨细胞的成熟肥大延迟。可见，Ihh对软骨细胞分化的调控作用有一部分是独立于PTHrP信号途径的。Mak等认为，Ihh可能激活了经典的Wnt／β-连环蛋白和骨形态发生蛋白（bone morpho-genetic protein，BMP）信号通路。
2.3调控成骨细胞分化的作用
核心结合因子-α1（core binding factor-α1，CBFA1）是Runt相关基因家族中的一员，特异性调节成骨细胞的分化。体外研究证实，Ihh通过促进Gli-2和抑制Gli-3上调CBFA1的表达，从而调节间充质细胞向成骨细胞的分化。Yoshida等发现在CbfA1+小鼠，Ihh的表达明显下降，而过表达CbfA1可恢复其表达水平，CbfA1可以直接诱导Ihh基因的转录。他们还证实，在Ihh基因的5’端有7个潜在的CbfA1结合区，其中3个可能是CbfA1调节Ihh转录的重要区域。
3 Ihh对TMJ生长发育的调控
在正常的生长发育过程中，髁突的生长方式属于软骨内成骨，软骨内成骨始于增殖层内未分化的间充质细胞的增殖和分化。前体软骨细胞分化为软骨细胞，再逐渐成熟分化为前肥大软骨细胞和肥大软骨细胞，细胞外基质由Ⅱ型胶原转变为X型胶原，之后新生血管长入，肥大软骨细胞发生程序性死亡，部分矿化的软骨逐渐被骨替代。在新生小鼠TMJ的软骨和软骨膜中，Ihh基因显著表达。Ihh+小鼠的髁突组织不能正常生长，结构紊乱，表现为增殖层PTHrP的高表达及细胞的增殖速率显著降低，具有增殖和分化功能的间充质细胞数量减少，软骨细胞的数量不足以维持髁突软骨的正常生长。Purcell等发现，Gli-2缺陷小鼠的TMJ发育异常，髁突组织失去了正常的细胞排列结构，无法形成关节盘。他们通过抑制Smo在始祖软骨细胞中的表达，使这些细胞不能激活Ihh信号通路，结果发现关节盘可以形成，但其却无法與髁突组织分离。由此可见，TMJ盘的形成和发育以及最后與髁突组织分离形成关节下腔，皆需要Ihh信号通路的调控。
4 Ihh对TMJ的生物力作用
下颌髁突软骨系继发性软骨，其出生后的生长改建易受生物力及多种生物学因素的影响，适当的力刺激有利于髁突软骨的发育及其正常结构、形态和功能的保持；反之则有可能造成髁突软骨的病理性改变，破坏其正常的结构和功能，进而导致TMJ退行性关节病的发生。Wu等在体外三维软骨细胞培养体系的研究中发现：在周期性机械应力刺激下，2d后软骨细胞中的Ihh mRNA的表达可增加18倍，软骨细胞明显增殖，而且这种促软骨细胞的增殖作用可以被Ihh的功能抑制抗体完全消除。他们还发现，BMP可促进Ihh诱导的软骨细胞增殖，BMP的拮抗剂头蛋白（nog-gin）可以抑制软骨细胞增殖，而PTHrP的拮抗剂却不能阻断软骨细胞的增殖活性。由此可见，Ihh的机械信号传导作用是BMP依赖性的，而PTHrP是非依赖性的。
有研究在功能前伸大鼠下颌时发现，其髁突软骨中Ihh mRNA及其蛋白表达显著升高并有大量新骨形成，而且Ihh蛋白的高表达與大量软骨细胞进入增殖期是同步的。Chen等通过磨切幼年雌性小鼠切牙使其TMJ异常受力，2～6周后其髁突软骨发育缺损，软骨下骨密度暂时性降低，同时Ihh基因的表达显著下调。由此推测，Ihh可能是将下颌髁突接受到的生物力学信号转化为生物学信号的重要递质。Lin等在研究中发现：在人的膝关节骨关节病软骨和手术诱导的小鼠膝关节骨关节病模型中，Ihh及其下游基因（Ptc1和Gli等）高表达；而在构建了抑制Ihh表达的转基因鼠膝关节骨关节病模型中，抑制Ihh的表达水平可以有效地缓解小鼠膝关节骨关节病的发展。然而，Ihh在TMJ骨关节病中的作用机制如何，国内外均未见报道，值得深入研究。
5 结论與展望
Ihh信号是在一个复杂的网络环境中，通过其受体PTC和SMO以及下游转录因子Gli等参與调控着软骨内成骨过程中软骨细胞增殖和分化以及软骨膜处间充质细胞向成骨细胞分化的速率；而且，Ihh是将生物力信号转化为生物学信号的重要分子途径，其在TMJ的胚胎发育和生长改建中的重要意义受到越来越多的关注。应用Ihh蛋白及其基因，精确地调控Ihh基因的表达，将为促进髁突软骨和关节盘改建提供新的思路。