新型乌贝速释片的生物等效性研究
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[摘要] 目的：制备一种新型乌贝速释片，并研究该剂型与乌贝散在Beagle犬体内的药代动力学和生物等效性。方法：采取粉末直接压片法制备乌贝速释片，将6只Beagle犬随机分为2组，分别口服给予乌贝速释片和乌贝散，采用LC-MS/MS测定给药后不同时刻血浆中贝母素甲的浓度，采用DAS 2.0软件按非房室模型处理得药动学参数，评价速释片剂与散剂的生物等效性。结果：乌贝速释片中贝母素甲的主要药动学参数为 Cmax （7.4±2.3） μg·L-1，AUC0-t（59.13±15.25） μg·L-1·h-1， Tmax （1.5±0.0） h，乌贝散中贝母素甲的主要药动学参数为 Cmax（8.0±1.7） μg·L-1，AUC0-t （68.78±16.27） μg·L-1·h-1， Tmax （1.5±0.0） h，乌贝速释片中贝母素甲的lnAUC0-t 和ln Cmax的90%置信区间分别为乌贝散相应参数的95.4%～104.6%，90.9%～109.1%。结论：自制的乌贝速释片与乌贝散具有生物等效性，且生产工艺简单，服用方便。
[关键词] 乌贝速释片；乌贝散；LC-MS/MS；药代动力学；生物等效性
[收稿日期] 2013-02-18
[通信作者] *陈慧，讲师，工程师，主要从事中药分析和质量控制研究，E-mail： 乌贝散是《中国药典》收录的成方制剂[1]，处方由海螵蛸、浙贝母、陈皮油组成，具有制酸止痛，收敛止血的作用，对由于胃酸过多而导致的胃病如胃痛泛酸，胃及十二指肠溃疡等具有明显疗效。散剂是中药传统剂型，易分散，有利于药物吸收并具有较快的药效，但具有不良的口感，服用、分装、贮存不便。如何改进中药传统剂型已经成为中药现代化研究的重点。
本研究制备了一种新型易分散的固体剂型，采用向乌贝散中添加适宜的辅料后压片，利用治疗过程中产生的泡腾作用使其在胃液中3 min内分散，并在胃壁上形成一层均匀的薄膜从而保护胃黏膜来抵御胃酸，既保留了散剂快速起效的优点，又克服了散剂的缺点；采用LC-MS/MS法对Beagle犬给药后不同时刻血浆中贝母素甲的浓度进行测定，得到其药代动力学参数，评价该剂型与散剂的生物等效性。
1 材料
1.1 仪器 TSQ Quantum Ultra三重四极杆串联质谱仪，配备电喷雾电离源；Xcalibur 1.4数据采集软件；LCquan 2.0定量处理软件（美国Thermo公司）；LC-10ADvp 输液泵（日本岛津公司）；SIL-HTA自动进样器（日本岛津公司）。
1.2 试药 海螵蛸（去壳，山东泰嘉中药饮片有限公司）；浙贝母（山东泰嘉中药饮片有限公司）；陈皮油（吉安市华天宝中草药生物制品厂）；贝母素甲（中国食品药品检定研究院，批号110750-200607）；甲硝唑（中国食品药品检定研究院，批号100191-200305）；甲醇（色谱纯，山东禹王化工厂）；二乙胺（色谱纯，山东禹王化工厂）；水为去离子水；其余试剂均为分析纯。
1.3 动物 健康Beagle犬，雌性，体重（9.3±1.0） kg，由北京科宇动物养殖中心提供，合格证号SCXK（京）2007-0003。
2 方法
2.1 乌贝散与乌贝速释片的制备 将海螵蛸85 g、浙贝母15 g粉碎成细粉，加入陈皮油0.15 g，混匀，过筛，即得乌贝散[1]。
将海螵蛸85 g、浙贝母15 g粉碎成细粉，加入陈皮油0.15 g、碳酸氢钠0.5 g，混合均匀，将混合物过筛、压成400个药片。按2010年版《中国药典》（一部）附录ⅠD片剂项下有关的各项规定进行检查。
2.2 对照品溶液及内标溶液的配制 精密称取贝母素甲对照品100 mg，置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解，定容，配制成1 000 mg·L-1的单一对照品储备液，精密量取适量，用甲醇稀释成6个不同浓度的系列对照溶液，质量浓度为0.20～100 μg·L-1。
内标溶液的配制：精密称取甲硝唑对照品10 mg，置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解，定容，配制成质量浓度为100 mg·L-1的内标储备液。精密量取内标储备液适量，用甲醇稀释成质量浓度为100 μg·L-1的内标溶液。
2.3 给药取血方法 6只健康雌性Beagle犬，随机分为2组，分别口服给予乌贝散剂和片剂，按0.33 g·kg-1体重给药，给药后0，0.5，0.75，1.5，2.5，3，4，5，6，8，10，12，24 h用肝素管通过内置管取血样3 mL，以4 000 r·min-1离心10 min，分离出血浆，于-20 ℃冷冻保存，7 d清洗期后，研究以同样的方式重复进行以完成交叉对照研究。
2.4 血浆样品处理方法 取血浆样品500 μL，分别加入氨水100 μL、甲硝唑内标溶液（100 μg·L-1） 50 μL，涡旋混合1 min后加入乙酸乙酯4 mL，再涡旋混合5 min，以6 000 r·min-1离心10 min，分别取上清液于另一个试管中，于40 ℃空气流下吹干，残留物加入流动相100 μL溶解，涡旋混合，取20 μL进行LC-MS/MS分析。
2.5 LC-MS/MS分析方法 液相色谱条件： Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；预柱Phenomenex C18保护柱（4.0 mm×8 mm）；流动相水（含1%的二乙胺）-甲醇（20∶80），流速0.5 mL·min-1；柱温20 ℃；进样量20 μL。
质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI）正离子化方式，源喷射电压4.2 kV，加热毛细管温度320 ℃；鞘气（氮气）压力207 kPa，辅助气（氮气）压力34.5 kPa，碰撞气（氩气）压力0.159 6 Pa；碰撞诱导解离（CID）电压分别为30 eV（贝母素甲）和20 eV（甲硝唑）；扫描方式为选择反应监测（SRM）；用于定量分析的离子反应分别为 m/z 432 414（贝母素甲）， m/z 172128（甲硝唑）；扫描时间0.3 s。
3 结果
3.1 乌贝速释片崩解时限测定 在37 ℃条件下，向250 mL烧杯中加入200 mL人工胃液（取稀盐酸16.4 mL，加水800 mL与胃蛋白酶10 g，摇匀后，加水稀释成1 000 mL，即得），并取1个药片放入，当药片停止冒出气泡时不得有颗粒物存在，平行测定6组，3 min内全部崩解并通过850 μm筛。
3.2 碳酸氢钠含量对崩解时间的影响 碳酸氢钠作为辅料加入到乌贝速释片中，可以有效促进片剂崩解，考察了碳酸氢钠含量对崩解时间的影响，见图1。当碳酸氢钠质量分数增加到0.5%，崩解时间不再显著减少，同时由于过量的碱越少，对人体的影响就越小，因此选择0.5%作为碳酸氢钠的加入量。
图1 碳酸氢钠含量对崩解时间的影响
Fig.1 The disintegration time changed with the fraction of sodium bicarbonate
3.3 碳酸氢钠对有效成分的稳定性考察 在加速试验（温度40 ℃，湿度75%）条件下，分别于0，1，2，3，6个月测定乌贝速释片中贝母素甲的含量，结果见表1。稳定性试验表明乌贝速释片中的有效成分在加速试验条件下稳定。
表1 乌贝速释片中有效成分稳定性试验
Table 1 Stability data of the effect component in Wubei fast-release tablet
注：性状均为类白色片。
3.4 专属性试验 贝母素甲和甲硝唑的产物离子质谱图见图2，SRM分别为 m/z 432414， m/z 172128。血浆样品中贝母素甲和甲硝唑的典型色谱图见图3，在本试验条件下，贝母素甲、甲硝唑的保留时间分别为2.39，1.64 min。结果表明，空白血浆中的内源性物质不干扰贝母素甲和内标甲硝唑的测定。
图2 贝母素甲（A）和甲硝唑（B）的产物离子质谱图
Fig.2 Product ion mass spectra of [M+H]+ ions of two components
3.5 标准曲线制备 将贝母素甲对照贮备液用空白Beagle犬血浆配制成系列对照溶液，分别测定峰面积。以血浆浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，回归方程为 Y =123.58 X-4.06 （ r =0.997），权重为1/ X 2。结果表明，贝母素甲在质量浓度0.20～100 μg·L-1线性关系良好。
3.6 精密度和准确度 取空白血浆500 μL，按3.5项下方法配制低、中、高3个浓度（贝母素甲血浆质量浓度分别为0.2，5.0，80 μg·L-1）的样品，每一浓度进行6个样本分析，连续测定3 d，根据当日的标准曲线，计算样品的测得浓度，将样品的测定结果进行方差分析，考察方法的精密度和准确度，结果见表2。
3.7 提取回收率 取空白血浆500 μL，按3.5项下方法配制低、中、高3个浓度（贝母素甲血浆质量浓度分别为0.2，5.0，80 μg·L-1）的样品，每一浓度进行6个样本分析；另取空白血浆500 μL，除内标溶液以甲醇-水（50∶50）替代外，其余按2.4项下
A.空白血浆；B.空白加对照品（0.20 μg·L-1）和内标；C. 给药0.5 h血浆样品；1. 贝母素甲；2. 甲硝唑。
图3 贝母素甲和内标的典型SRM色谱图
Fig.3 Representative SRM chromatograms of peimine and internal standard
操作，所得残留物用含相同浓度贝母素甲的流动相溶解，每一浓度进行3样本分析。以每一浓度2种处理方法的峰面积比值计算回收率，结果见表2。
表2 Beagle犬血浆中贝母素甲浓度的精密度和准确度（ n =6）
Table 2 Precision and accuracy of peimine concentrations in Beagle dog plasma（ n =6）
3.8 药代动力学研究 应用上述分析方法测定Beagle犬口服乌贝散和乌贝速释片后不同时刻血浆中贝母素甲的浓度，血药浓度-时间曲线见图4。用DAS 2.0软件按非房室模型计算药动学参数，达峰浓度（ Cmax）和达峰时间（ Tmax）采用实测值，用梯形法计算AUC，以血药浓度对时间作半对数曲线，取消除相时间点进行线性拟合，求算消除速率常数 ke和 T1/2。主要药代动力学参数见表3。
图4 Beagle犬口服乌贝散和乌贝速释片后贝母素甲药-时曲线（ n =6）
Fig.4 Plasma concentration-time profile of peimine in Beagle dog after oral administration of Wubei powder and Wubei fast-release tablet（ n =6）
表3 Beagle犬口服乌贝散和乌贝速释片后贝母素甲的药代动力学参数（ ±s ， n =6）
Table 3 Pharmacokinetic parameters of peimine in Beagle dog after oral administration of Wubei powder and Wubei fast-release tablet（ ±s ， n =6）
3.9 生物等效性评价 将 Cmax和AUC0-t 对数转换后进行方差分析，结果表明2种制剂间及2个试验周期间均无显著性差异。进一步采用双单侧 t 检验和（1-2 α ）%置信区间法进行生物等效性评价，乌贝速释片中贝母素甲的lnAUC0-t 和ln Cmax的90%置信区间分别为乌贝散相应参数的95.4%～104.6%，90.9%～109.1%。 Tmax经非参数法（配对Wilcoxon法）检验，两者无显著差异。根据以上结果，表明2种制剂具有生物等效性。
4 讨论
目前，有3类分散固体剂型：分散片[2]、泡腾片[3]和溶液片[4]，这3类剂型便于运输、贮存和使用，但适用范围仍有一定限制。分散片需要有特别高效的崩解剂，从而导致价格较高[5]；泡腾片需要泡腾剂和水溶性的辅料，而且不能用于和酸或碱反应的药物，同时对制剂环境要求较高[6-7]；溶液片适用的药物范围较窄从而限制了其应用[8]。
本研究制备了一种新型乌贝速释片，可以通过将药材粉末直接压片而不用添加如崩解剂、黏合剂等任何其他的辅料，最终得到脆碎度、分散均匀性、重量差异均符合2010年版《中国药典》规定的片剂，这与海螵蛸中含有80%～85%的碳酸钙，且碳酸钙具有良好的成形性有关[9-10]。
乌贝速释片利用了普通泡腾片产气的原理促进片剂的崩解，但与普通泡腾片不同的是，它只含有碱性成分而不含酸性成分，因此，它只有在胃中遇到胃酸时才会泡腾产气，同时由于该剂型中碱含量较少以至于产生的气体不会导致腹胀、嗳气或打破身体平衡，其优点在于运输、贮存和使用较为方便；相对于生产普通泡腾片和分散片严格的湿度控制，该剂型的湿度控制范围较宽；不需要高效的崩解剂；产生的气泡可以使药物均匀地分散成大量的泡沫而立即起效，同时在胃壁上形成一层均匀的薄膜保护胃黏膜来抵御胃酸，因此，这种剂型特别适用于胃药。
传统中药在调理胃肠道功能方面都有着独特的优势[11]，将具有可靠治疗效果的胃肠道中药改进成速释片会带来一些意想不到的效果，从而成为中药现代化发展的一个方向。
本研究用贝母素甲作为标记物来考察2种剂型口服给药的体内过程，用DAS 2.0软件对实验结果进行处理，按非房室模型拟合药代动力学参数，结果表明，乌贝速释片与散剂具有生物等效性，且制备工艺简单，使用、贮存更为方便，有良好的应用价值。
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Study on bioequivalence of new Wubei fast-release tablet
CHEN Hui GAO Sheng-bin LI Li-juan， YAN Rui， JI Yue，（1.Department of Pharmacy， Hebei Chemical and Pharmaceutical College， Shijiazhuang 050026， China；
2.CSPC Zhongnuo Pharmaceutical（Shijiazhuang） Co.， Ltd.， Shijiazhuang 050041， China；
3.School of Pharmacy， Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang 110016， China）
[Abstract] Objective： To prepare a new Wubei fast-release tablet and study the pharmacokinetics and bioequivalence of self-prepared Wubei fast-release tablet and Wubei powder in Beagle dogs. Method： Wubei fast-release tablet was prepared with direct powder compression. Six Beagle dogs were randomly devided into two groups. They were orally administered with Wubei fast-release tablet and Wubei powder， respectively. Peimine concentrations in human plasma were determined by HPLC-MS/MS after administration. The pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 using a non-compartmental analysis. The bioequivalence of fast-release tablet and powder was evaluated. Result： The main pharmacokinetic parameters of peimine in Wubei fast-release tablet as follows： Cmax（7.4±2.3） μg·L-1， AUC0-t （59.13±15.25） μg·L-1·h-1， Tmax（1.5±0.0） h. The main pharmacokinetic parameters of peimine in Wubei powder as follows： Cmax（8.0±1.7） μg·L-1，AUC0-t （68.78±16.27） μg·L-1·h-1， Tmax（1.5±0.0） h. The 90% confidence interval of lnAUC0-t and ln Cmax of peimine in Wubei fast-release tablet were 95.4%-104.6%， 90.9%-109.1% of corresponding parameters of Wubei powder， respectively. Conclusion： The self-prepared Wubei fast-release tablet and Wubei powder were bioequivalent. And the self-prepared Wubei fast-release tablet had simple production process， easy administration.
[Key words] Wubei fast-release tablet； Wubei powder； LC-MS/MS； pharmacokinetic； bioequivalence
doi：10.4268/cjcmm20131635