批量筛检献血者不规则抗体的方法

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【关键词】 献血者;不规则抗体;批量筛检

作者单位:454150 河南省焦作市中心血站

现代输血技术的核心理念是安全和有效输血。近年来,由于血液传染性指标的检测技术不断进步,经输血传染病毒的危险性已大幅度降低。但是,由于人类血型抗原系统的复杂性,由输血引起的输血免疫反应时有发生[1]。保证患者输注免疫学“相容”的血液,预防输血不良反应,已成为广大输血工作者的重要研究课题。我国专家多年前就已经提出,输血前应对受血者和供血者的红细胞不规则抗体进行筛选 [2],以提高临床输血的安全性和有效性。但常规的试管法由于费时繁琐,不可能对大量献血者的不规则抗体进行批量筛检。为此,笔者将96孔U型微板看作是96个“短”试管的联合体,将间接抗人球蛋白试验改良后在微板中进行,使献血者不规则抗体的批量筛检简单易行,和试管法对比效果良好,现报告如下。

1 材料和方法

1.1 试剂 抗人球蛋白试剂(IgG)、抗-D(IgG)、筛选细胞、谱细胞由上海血液生物医药有限责任公司提供;抗-C、抗-c、抗-E、抗-e、抗-Fya、抗-JKa由加拿大Dominion Biologicals Limited公司提供;所有试剂均在有效期内使用。指示细胞由笔者在使用当天配制。

1.2 仪器设备 AT全自动样本处理系统(瑞士HAMILTON公司);Labofuge400平板离心机(美国Beckman公司);HH.W21.600型电热恒温水浴箱(北京光明医疗仪器厂);HTⅢ扫描酶标仪(奥地利ANTHOS公司);KA-2200血球洗涤离心机(日本KUBOTA公司);TG-328A光学分析天平(湘仪天平仪器厂); 96孔硬质U形微型板(丹麦Nunc公司)。

1.3 检测样品

1.3.1 19份已知不规则抗体为阳性的献血者和受血者血清(由日常工作中用试管法筛查并已用谱细胞确定了抗体特异性),用该法重新进行抗体筛查。

1.3.2 7份标准抗血清:将抗-D(IgG)、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e、抗-Fya、抗-JKa分别倍比稀释后,和试管法平行测定其效价。

1.3.3 分批次随机抽取本站无偿献血者标本2160份(2009年1月～2009年6月,每周三次,每次30份),和试管法平行筛查其不规则抗体,阳性结果用谱细胞确定抗体的特异性。

1.4 醛化、包被筛选红细胞

1.4.1 将筛选红细胞用生理盐水洗涤3次,再用pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤1次,用含3.4%葡萄糖的磷酸盐缓冲液配制成1%的红细胞悬液。

1.4.2 用0.05%的戊二醛处理微板,每孔加入100 μl,静置20 min,弃去,生理盐水洗涤1次。

1.4.3 将1%筛选红细胞加入微孔板中,每孔50 μl,300 g离心2 min,使红细胞平铺孔底,静置20 min。

1.4.4 用生理盐水洗涤3遍,每次均轻轻拍干备用。

1.5 抗人球蛋白试剂的稀释 用微板法对比试验,确定抗人球蛋白试剂的最佳稀释度为1∶3。

1.6 指示细胞的配制:将3人份O型红细胞混合,用生理盐水洗涤3次,取适量压积红细胞等量加入IgG抗-D血清,37℃孵育30 min,离心去上清,用生理盐水洗涤5次,再用pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤1次,用含3.4%葡萄糖的磷酸盐缓冲液配制成1%的红细胞悬液备用。

1.7 检测

1.7.1 用AT全自动样本处理系统将检测样品加入醛化、包被好筛选红细胞的微板中,每孔100 μl,同时做阳性、阴性对照各2孔,阳性对照加入与筛选细胞含有对应抗体的血清100 μl,阴性对照加入AB型血浆100 μl,37℃孵育30 min。

1.7.2 弃去孔内液体,用生理盐水洗涤5遍,每次均轻轻拍干。

1.7.3 加入稀释好的抗人球蛋白试剂,每孔50 μl。

1.7.4 加入稀释好的指示细胞,每孔50 μl。

1.7.5 1200 g离心2 min,孔内红细胞呈扣状沉淀为阴性,平铺于孔底为阳性。

1.7.6 用酶标仪判读结果 根据孔内指示细胞分布情况,用酶标仪判断结果。

2 结果

2.1 19份抗体阳性标本阳性检出率100%,未出现假阴性。

2.2 7种抗血清效价比较,相差不超过1个滴度,见表1。

2.3 2160份献血者标本,试管法检出5份,阳性检出率0.23%,微板法检出7份,阳性检出率0.32%,经谱细胞确认,具有临床意义的特异性抗体均为5份,分别为1份抗-D、2份抗-E、1份抗-M、1份抗-c,说明微板法有一定的假阳性。

表1

微板法和试管法检测7种抗血清效价比较

DCcEeFyaJKa

微板法6432166446432

试管法643286446464

3 讨论

随着输血事业的不断发展,聚凝胺、凝胶试验、酶法等新的不规则抗体检测方法被广泛应用。但确定不完全抗体的最可靠方法仍然是抗人球蛋白法[3]。在本报告中,笔者使用的微板法原理仍是抗人球蛋白试验,改良的核心是将筛选红细胞(抗原)固定在微板的底部,加入血清(抗体)孵育反应后,洗涤时不需要离心,包被的筛选红细胞也脱落很少,当加入抗人球蛋白试剂和指示细胞后,结果非常容易观察和判读,从而克服了传统试管法费时费力的弊端,使试验变得方便快捷。另外笔者还利用了醛化红细胞具有较强的吸附蛋白质抗原或抗体的能力的原理[4],用戊二醛处理微板固定红细胞,不但使红细胞和板底结合的更牢固均匀,同时也提高了试验的灵敏度,更宜于结果判读。本法还具有以下两方面优点,一是标本量大时,可利用全自动设备加样和判读结果,使检测批量化;二是因抗人球蛋白试剂需要稀释而降低了成本。不足之处是存在一定的假阳性,但和假阴性比较可以进一步保证输血安全。由此可见,微板法抗人球蛋白试验具有良好的稳定性和灵敏性,且简单、易行、高效,完全可以替代试管法对献血者和受血者进行不规则抗体筛检。

参 考 文 献

[1] 田兆嵩.临床输血学.人民卫生出版社,2002:246.

[2] 王培华.输血技术学.人民卫生出版社,1998:147-150.

[3] 李勇,杨贵贞.人类红细胞血型学实用理论与实验技术.中国科学技术出版社,1999:158.

[4] 邢培清,刘玉振.实用输血检验.郑州大学出版社,2001:195.