凡纳对虾crustin 2基因的序列及结构分析

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摘要：以凡纳对虾（Litopenaeus vannamei）crustin 2基因为研究对象，通过基因克隆、氨基酸序列比对、系统进化树分析以及分子结构的初步预测。结果表明，crustin 2基因可能在凡纳对虾的先天免疫系统中发挥着重要的抗菌功能，是一个重要的免疫效应基因。

关键词：凡纳对虾（Litopenaeus vannamei）；crustin 2基因；克隆；分析

中图分类号：S917.4；Q781 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）18-4526-03

凡纳对虾（Litopenaeus vannamei）具有良好的抗菌、抗病毒等遗传特性。其先天免疫系统一直是研究热点，科研工作者试图通过研究抗菌、抗病毒相关的基因来发现凡纳对虾优良性状的分子生物学基础[1]。本研究以凡纳对虾crustin 2基因为研究对象，克隆了该基因的cDNA序列，并对基因序列的同源性、分子进化上的亲缘关系、初级结构等进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料

凡纳对虾购自于包头市友谊水产市场，并于超净工作台中剖取凡纳对虾肝胰腺、鳃等组织，用于提取总RNA。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成 参照说明书，利用TRizol总RNA提取试剂盒提取凡纳对虾的肝胰腺和鳃等组织的总RNA[2]，于-80 ℃冰箱中保存备用。按照cDNA第一链合成试剂盒的操作说明书，将总RNA逆转录为cDNA。

1.2.2 目的片段的PCR扩增 以提取的凡纳对虾的总RNA反转录成的cDNA为模板进行PCR扩增[3]。利用前引物F和反转录使用的后引物3′ anchor R引物配对，来扩增目的基因的ORF的3′端序列；同时利用后引物R和反转录使用的前引物5′ PCR primer引物来扩增目的基因ORF的5′端序列，通过已有的中心片段以及两端片段拼接来获得基因的完整cDNA序列。

1.2.3 重组载体的构建与序列测定 使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因PCR扩增产物，将目的基因回收、纯化之后，参照T载体PCR产物克隆试剂盒使用说明书，将目的基因片段克隆到T载体中，经过蓝白斑筛选后，进行序列测定[4]。

1.3 生物信息学分析

1.3.1 氨基酸序列比对 将凡纳对虾crustin 2基因的cDNA序列进行比对。用Expasy在线软件对crustin 2基因进行翻译，预测蛋白质序列信号肽和结构域；氨基酸序列比对利用分子生物学软件DNAMAN完成[5]。

1.3.2 系统进化树的绘制 根据凡纳对虾crustin 2基因序列比对的结果，选择物种相近的生物的crustin 2基因，利用分子生物学软件MEGA 4.0进行系统进化树的绘制[6]。

1.3.3 分子结构的预测 根据Expasy在线软件对凡纳对虾crustin 2基因序列进行翻译的结果，利用SMART网站中蛋白质分子初级结构域预测工具进行分子结构的初步预测。

2 结果与分析

2.1 基因克隆和序列分析

以凡纳对虾各组织的总RNA反转录的cDNA作为模板，利用特异性引物F和R以及反转录过程中使用的引物5′ PCR primer和3′ anchor R扩增凡纳对虾crustin 2基因cDNA序列。结果（图1）表明，凡纳对虾crustin 2基因cDNA序列的ORF长度为456 bp，编码151个氨基酸；并且在ORF的下游2 bp处存在一个加尾信号AATAA序列。在氨基酸序列中，N端的18个氨基酸组成了信号肽序列，靠近C端的49个氨基酸形成了一个经典的WAP结构域，其中包括了8个保守存在的半胱氨酸。在信号肽序列与WAP结构域序列之间，存在着富含甘氨酸的基序以及保守存在的另外4个半胱氨酸。

2.2 氨基酸序列的同源性分析

将克隆得到的凡纳对虾crustin 2基因（Lva-crustin 2）cDNA序列，进行基因序列BLAST比对，选择了cDNA序列同源性较高的5种相近物种的crustin基因，进行氨基酸序列的同源性比对分析。结果表明，巴西美对虾（Farfantepenaeus brasiliensis）crustin基因（Fbr-crustin）、小褐美对虾（Farfantepenaeus subtilis）crustin基因（Fsu-crustin）、南美蓝对虾（Penaeus stylirostris）crustin基因（Pst-crustin）、大西洋白对虾（Litopenaeus setiferus）crustin基因（Lse-crustin）、斑节对虾（Penaeus monodon）crustin基因（Pmo-crustin）均与凡纳对虾crustin 2基因（Lva-crustin 2）氨基酸序列上具有较高的同源性。氨基酸N端的信号肽序列的相似性较高，C端都存在着一个WAP结构域。信号肽序列与WAP结构域之间的富含甘氨酸的基序（Gly-rich motif）以及保守存在的另外4个半胱氨酸相似程度特别高。

2.3 凡纳对虾crustin 2与其他对虾crustin的亲缘关系分析

对凡纳对虾crustin 2基因（Lva-crustin 2）序列进行BLAST比对之后，利用分子生物学软件MEGA 4.0进行相近物种的crustin系统进化树的分析与绘制。结果（图2）表明，凡纳对虾crustin 2与南美蓝对虾crustin（Pst-crustin）、大西洋白对虾crustin（Lse-crustin）分布在进化树的同一支上，说明亲缘关系较近，也表现出了较高的氨基酸序列相似性。

2.4 凡纳对虾crustin 2的结构预测

利用蛋白质结构域预测工具SMART网站，对凡纳对虾crustin 2的结构进行初步预测。凡纳对虾crustin 2属于典型的crustin类抗菌肽，存在经典的WAP结构域和信号肽序列，WAP结构域和信号肽序列之间存在另外4个保守的半胱氨酸以及一段富含甘氨酸残基的结构基序。推测凡纳对虾crustin 2应该具有抗菌活性。

3 小结与讨论

以凡纳对虾crustin 2基因（Lva-crustin 2）为研究对象，克隆了凡纳对虾crustin 2基因的cDNA序列，进行了氨基酸序列的比对分析以及通过绘制系统进化树来分析各个对虾crustin与凡纳对虾crustin-2之间的亲缘关系情况，初步预测了分子结构。结果表明，凡纳对虾crustin 2属于典型的甲壳肽抗菌肽，其氨基酸序列结构符合甲壳肽的结构特征，存在WAP结构域和富含甘氨酸的结构基序，推测凡纳对虾crustin 2应该具有抗菌活性，在凡纳对虾的先天免疫系统中可能发挥着重要的抗菌功能，为下一步基因功能的研究提供了重要的理论基础。

参考文献：

[1] DU Z Q， REN Q， ZHAO X F， et al. A double WAP domain （DWD）-containing protein with proteinase inhibitory activity in Chinese white shrimp， Fenneropenaeus chinensis[J]. Comp Biochem Physiol Part B： Biochem Mol Biol，2009，154（2）：203-210.

[2] DU Z Q， LI X C， WANG Z H， et al. A single WAP domain （SWD）-containing protein with antipathogenic relevance in red swamp crayfish， Procambarus clarkia[J]. Fish & Shellfish Immunol，2010，28（1）：134-142.

[3] SUN C， DU X J， XU W T， et al. Molecular cloning and characterization of three crustins from the Chinese white shrimp，Fenneropenaeus chinensis[J]. Fish & Shellfish Immunol，2010，28（4）：517-524.

[4] JIA Y P， SUN Y D， WANG Z H， et al. A single whey acidic protein domain （SWD）-containing peptide from fleshy prawn with antimicrobial and proteinase inhibitory activities[J]. Aquaculture，2008，284（1）：246-259.

[5] CHEN D， HE N， XU X. Mj-DWD， a double WAP domain-containing protein with antiviral relevance in Marsupenaeus japonicas[J]. Fish & Shellfish Immunol，2008，25（6）：775-781.

[6] JIM？魪NEZ-VEGA F， YEPIZ-PLASCENCIA G， S？魻DERH？魧LL K，et al. A single WAP domain-containing protein from Litopenaeus vannamei hemocytes[J]. Biochem Biophys Res Commun，2004，314（3）：681-687.