野生粗毛淫羊藿生长周期的形态特征及淫羊藿苷的含量分析

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[摘要] 目的：阐明野生粗毛淫羊藿植物生长周期的形态特征与次生代谢物积累水平。方法：明确生境，运用形态观察、标本制作、生物绘图记录不同时期植物的形态特征；采用HPLC检测不同生长阶段植株各部位的淫羊藿苷含量。结果：粗毛淫羊藿生长周期可划分为营养生长阶段和有性与无性繁殖并存阶段。在林缘旷地生境中，植株需经7～8年的营养生长方开花结实，但在良好营养条件下，生长周期缩短至3～4年。植株营养生长期与有性繁殖期的淫羊藿苷总体水平没有显著性差异。结论：营养生长和有性繁殖初期可通过叶部的形态变化判断生长年限，但植株成年、根茎兼行无性繁殖策略后，难以从形态上判断植株年龄。在药材采挖上，药材品质受生长阶段的影响不明显，只要产量（生物量）达到经济合算，各生长阶段均可采挖。

[关键词] 粗毛淫羊藿；生长周期；克隆植物

[收稿日期] 2013-05-31

[基金项目] 国家科技基础性工作专项重点项目（SB2007FY020）；中国中医科学院中药研究所基本科研业务费自主选题项目（2011ZDXK-01）；贵阳市科技创新公共技术平台建设项目（2010筑科合字第3-2号）

[通信作者] *周涛，教授，主要从事中药资源的调查、整理研究，Tel：（0851）5622506，E-mail：

淫羊藿作为常用大宗中药，除供药材使用外，其提取物还广泛用于化妆品、保健品、化工以及出口，资源需求日益增加。但对于淫羊藿属植物资源而言，属下“种”的资源分布表现出明显的区域化，缺乏广布种，造成淫羊藿药材的基源种类有所不同[1]。《中国药典》2010年版即收录淫羊藿Epimedium brevicornu、箭叶淫羊藿E. sagittatum、柔毛淫羊藿E. pubescens、朝鲜淫羊藿E. koreanum及巫山淫羊藿E. wushanense（单列）5个种作为淫羊藿药材来源[2]。实际上，在各地方标准和民间传统中被作为淫羊藿药材使用的有10多个种。其中，粗毛淫羊藿E. acuminaum因其药材中淫羊藿苷含量较高，为2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》所收载并已成为贵州淫羊藿药材的主流品种之一[3]。

淫羊藿植物资源的更新研究涉及到资源蕴藏量、经济量、年允收量、采收周期等评估工作，这是开展和规划淫羊藿植物资源保护和可持续利用的理论基础。但要开展这方面的研究工作，首先要获知药用植物的生长周期及其生长习性等特征。但对于淫羊藿属植物，近些年来的研究工作主要集中在属内物种的资源分布[1，4]、化学成分[5]、药理作用[6-7]、植物生理[8]等方面，而在资源种群分布、年龄结构、生长周期及其更新周期等方面的研究鲜见报道，特别缺乏有关植物生长发育中形态特点与变化规律的记载。本文基于前期探讨粗毛淫羊藿药材品质与生境的研究工作，对野生粗毛淫羊藿植物的生长发育进行了持续定期的观察和形态记录，旨在寻找植物不同生长时期的形态特征和判断依据，为阐明该物种自然生长特性、种群分布与资源的可持续利用研究提供基础理论依据。

1 研究地区与研究方法

1.1 观察地区概况

贵阳市乌当区地处黔中腹地，位于东经106°30′～107°03′，北纬26°33′～26°55′，海拔1 100～1 400 m。亚热带高原湿润性季风气候，年均温度14.6 ℃，年日照数1 205.8 h，年降水量1 188 mm，年无霜期288 d。境内土壤以酸性黄壤为主，与石灰岩、白云岩、砂岩、页岩等交错分布。地带性植被为中亚热带湿润性常绿阔叶林，以壳斗科、樟科、山茶科植物为主。观察地为林缘旷地生境，无乔、灌木层植被，土层瘠薄，粗毛淫羊藿茎短而细，叶片较小，分枝少，叶色枯绿，植株高在13～48 cm[9-10]。

1.2 研究方法

1.2.1 形态特征观察 2010年1月―2012年7月，在明确调查地区粗毛淫羊藿自然种群分布基础上，每个月在观察地设置1 m × 2 m的样方1～2个，记录生境类型、样方经纬度、海拔以及伴生植物种类。将样方内粗毛淫羊藿植株全部挖出，带回实验室清洁整理、制作标本后，观察、记录每株植株的生长状况、叶部形态，花枝、根茎节数等，判断植株生长周期与龄级，对凭证标本进行生物绘图。

1.2.2 不同生长阶段淫羊藿苷的含量测定 在林缘旷地和灌木林生境的粗毛淫羊藿样方中，分别选取营养生长（生殖前期）阶段、有性生殖（开花结实）阶段的植株各10株，分离为根、地下茎、地上茎、叶片4个器官部位，各部位混合，获得2个生境、4个部位、2个生长阶段的样本16份，60 ℃干燥、60目粉碎、备用。

以淫羊藿苷为检测指标，参照《中国药典》2010年版一部淫羊藿药材含量测定项下进行。色谱条件：岛津LC-10AT型液相色谱仪，Ultimate C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈-水（30∶70），检测波长 270 nm，流速 1.0 mL ・ min-1，进样量 10 μL。

1.2.3 分析方法 采用SPSS 17.0软件进行标准差、相关性分析。

2 结果

2.1 形态观察

植物的生长周期是指种子萌芽为实生苗到植物产生种子的过程。就本文考察生境的野生种群来看，粗毛淫羊藿的生长周期可分为2个阶段：1～5（6）龄植株的营养生长阶段和7（8）龄后的有性与无性生殖并存阶段。

2.1.1 营养生长（生殖前期）阶段 淫羊藿属种子均具有形态生理性休眠的特性[11]，粗毛淫羊藿种子也不例外，自然环境下可休眠半年。在林缘旷地生境中，种子早春2～3月打破休眠，下胚轴伸长，子叶出土式萌发。幼苗高3～11 cm，主根明显，真叶1枚，单叶，心形，子叶宿存。次年，子叶脱落，脱落处有不定根生成，主根渐退化。植株当年新生单叶1～3枚，原基生叶保留，共具2～5枚单叶。第3年，植株主根进一步退化，不定根增加，地下茎形成，并呈结状；植物新生单叶1～3枚，基部被短伏毛，第2年的单叶尚存，色黄绿，革质，柔韧，第1年的叶多凋落或枯萎，全株共有基生小叶3～6枚。第4年，植株根茎结节状增粗，其上密生须根，有芽痕；新生单叶1～3枚。第5年，地下根状茎增粗，呈结节状或结团状横走，节间具棕褐色膜质鳞片，节上密生不定根，长可达10 cm；植株新生叶为一回三出复叶，基生，有小叶3枚，纸质或薄革质，狭卵形，顶生小叶基部裂片圆形，侧生小叶以顶生小叶呈对称分布，基部裂片极度向外偏斜。有一些植株若呈现2枚新叶，则1枚复叶，1枚为单叶。自第6年开始，植株每年萌生的新叶均为复叶，不再有单叶，见图1。

A.1龄实生苗；B.2龄植株；C.3龄植株；D.4龄植株；E.5龄植株；F.8龄植株。

图1 粗毛淫羊藿不同生长年限植株形态

Fig.1 The different age of phytomorph figure of Epimedium acuminaum

综上所述，在林缘旷地生境中，野生粗毛淫羊藿植物的营养生长期持续了5～6年，有2个较明显的形态变化：一是单叶向复叶转化，前4年的植株均为单叶，第5年呈现一回三出复叶（或复叶伴单叶）；二是主根退化，根状茎形成。第6年，新生叶为复叶，尚不具花枝，植株仍处于营养生长期。

2.1.2 有性生殖和无性生殖并存阶段 植株至7年进入既开花结果又有块根膨大的有性和无性生殖并存阶段。特点一是植株早春萌生花芽，花茎具2枚对生复叶，有时3枚轮生。当环境或气候条件适宜，完成开花结果后，部分植株会产生第2轮新叶，为营养叶，继续进行营养生长；二是植株在具备种子繁殖的同时，植株根茎也能够通过分株形成2个独立的部分，分株在一定时期内由间隔子（根状茎）连接，即粗毛淫羊藿具有克隆生长的习性。因此，正是由于上述生理特性，当粗毛淫羊藿植株成年后就很难通过根茎的芽痕、植物地上叶形态判断其确切的生长年限，见图2。

A.花枝与花；B.根状茎；C.成熟果实与种子。

图2 粗毛淫羊藿器官形态特征

Fig.2 The organ morphologies of Epimedium acuminaum

2.2 不同生长阶段的淫羊藿苷积累情况

本文以淫羊藿苷为指标，以灌木林生境为对 照，考察林缘旷地生境下粗毛淫羊藿在营养生长期（繁殖前期）和有性繁殖期植株各部位中淫羊藿苷的含量。结果显示，无论阴蔽还是开阔环境，在营养生长阶段与在有性繁殖阶段，植株各部位中的淫羊藿苷含量没有显著性差异。此外，前期分析粗毛淫羊藿植株在不同生境中，各营养部位淫羊藿苷的分布格局为叶片>根>茎>根茎[9]，本文的分析结果与之一致，均表现为在生长周期内，叶部的淫羊藿苷积累最高，其次是根与根茎，茎中的含量最低。总体上表现出该成分具有特定部位积累的趋势。由于生物量占主导的是根茎部位，地下部分（根茎、根）的含量偏高，当药材用全株时，药材品质受其影响最大，见表1。

表1 2种生境下植株营养部位在不同生长期的淫羊藿苷含量（±s，n=5）

Table 1 The contents of icariin of different growth cycle in the 2 habitats of Epimedium acuminaum（±s，n=5）

注：差异显著性分析取α=0.05水平，同列字母不同为差异显著。

3 讨论

3.1 不同生长年限的生物学特征

孙超等[12]对粗毛淫羊藿的物候期、叶片生长特性、开花结实习性进行了记录，描述植物具有2次萌叶现象，这是成年植株在生境和营养适宜的条件下产生的：第1轮叶带花枝，第2轮为营养叶。但生境不适宜或营养条件受限时，一般植株1年只生长1次叶。

粗毛淫羊藿种子从萌发到开花结实的生长过程，有4～8年不等。即在适宜生境和营养充裕条件下，植株最早可在第3年即出现复叶，根茎迅速膨大，第4年进入开花结实。而当处于不良或胁迫生境中，植株可能需要5～6年完成营养生长，第7～8年方能开花结实。本文所观察的粗毛淫羊藿植株位于林缘旷地生境中，受日照、植物竞争和人为干扰影响较大，植株生长发育较为缓慢，生长周期可长达8年左右。在营养生长阶段，叶会呈现从单叶向复叶的变化，1～4龄植株均为单叶，根茎不发达。生长第5年植株出现一回三出复叶，基生；根茎膨大横走，芽仅少数正常发育，多为冗余芽。当植株呈现复叶后，预示次年会有花枝萌出。第8年有带叶花枝萌出，具备开花结实的能力，根茎结节状膨大横走。

判断野外粗毛淫羊藿植株生长年限最直观的依据是观察叶的形态：如果植株只有单叶，或兼具1～2枚基生复叶，生长年限在4～6年。具有花茎后，则只能依据宿存茎生复叶数估测植物的生长年限了。由于尚不清楚自然群落中成年植株的克隆习性，对于具备有性繁殖和兼有无性繁殖（根茎分株）能力的植株，更难凭植株形态准确推断其生长年龄了。

随着对粗毛淫羊藿生物学特性及与环境关系的逐步了解，对之生长发育与环境关系的认识也在不断加深，如作者前期认为植株在林缘旷地生境中的生物量累积增加可能是植株能更多获得阳光，生长代谢增强之故，却未考虑其生物学特性。实际上，作为一种喜阴植物，粗毛淫羊藿在阴蔽生境中地上部分长势茂盛，开花结实较多，而生长于旷地生境中的植株长势较差，少有开花和结实。这正是植株因环境不适宜，转为加强根茎保存、贮藏营养，同时采取克隆繁殖代替种子繁殖以保持种群生存的策略。

3.2 根状茎的起源

根状茎是粗毛淫羊藿植株重要的器官构件。成年植株根状茎所占生物量的比重最大，那么淫羊藿的根茎是如何形成的呢？观察发现，种子萌发后，下胚轴发展为幼茎，主根在第二年即退化，子叶残基处须根逐渐增长，幼茎逐渐转入土层成为地下茎，在随后生长岁月中结节状膨大、横走，最终形成根状茎。

3.3 淫羊藿苷的含量水平

从不同生境下植株各器官构件生物量的比例来看，根状茎在林缘旷地生境中的生物量是最高的，而叶片生物量则是最低的[10]，表明此生境为该植物非适宜生境。前期研究发现，植株的次生代谢物淫羊藿苷积累水平与生境有关，在旷地生境下的淫羊藿苷含量高于阴蔽生境下[9]，进一步证明粗毛淫羊藿具有明显的逆境效应，并不是作者前期所认为的充裕阳光下植株生理活动增强所致。作为多年生植株，粗毛淫羊藿不仅在不同生境中的生物量差异较大，且在同一生境下的生物量差异也较大，后者是个体生长年限的因素。本文的结果显示，无论开阔还是阴蔽生境，植株在营养生长期与有性繁殖期的淫羊藿苷总体水平没有显著性差异，只要植株生物量在药材采挖上经济合算，在营养生长阶段与有性繁殖阶段均可采挖。

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Morphological character of growth cycle for Epimedium

acuminatim and icariin content analysis

ZHOU Tao， XIONG Hou-xi， LIN Ge， JIANG Wei-ke， GUO Lan-ping， LEI Min， CHEN Chuan-yi， ZHANG Xiao-bo

（1.Guiyang College Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550002， China； 2.National Resource

Center for Traditional Chinese Materia Medica， China Academy of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100700， China）

[Abstract] Objective： To study the relationship between morphological characteristics of growth cycle for Epimedium acuminatium and accumulation level of secondary metabolites. Method： After making habitat clear， methods of morphology observation， specimen preparation， organism charting were applied to record morphological characteristics of E. acuminatium at different stages. HPLC was employed to detect icariin content of different parts of the plant at the stage of vegetative growth and sexual reproduction. Result： The growth cycle of E. acuminatium was divided into vegetative growth stage and sexual and asexual reproduction coexistence stage. Seven to eight years were needed for the plants flowering and seeding of E. acuminatimcan in open land of forest edge， but within good nutrition conditions， growth cycle is shortened into three to four years. The difference of icariin content in two growth stages was not significant. Conclusion： Morphological change of lower and foliar organ can be utilized to estimate growth age. But after applying sexual propagation for both root and stem of grown plants， it′s been difficult to determine their growth year. If individual biomass or yield is economical， plants can be harvested in both vegetative growth and sexual reproduction stages.

[Key words] Epimedium acuminatim； growth cycle； clonal plant