线拴法建立小鼠局灶性脑缺血再灌注模型的经验总结

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摘要：目的 建立小鼠局灶性脑缺血再灌注模型，并总结经验教训。方法 从颈外动脉插入栓塞线至颈内动脉，选择性栓塞大脑中动脉，造成大脑中动脉闭塞的动物模型。通过控制再灌注时间，观察其对小鼠神经行为学、脑缺血程度及存活期的影响。结果 除假手术组未制成脑缺血模型外，其他3组均于手术后24h出现神经行为学异常，脑切片TTC染色可见缺血病灶。结论 小鼠局灶性脑缺血再灌注模型制造成功，小鼠术后的成活率、梗死体积、神经行为学表现与手术方法密切相关。

关键词：小鼠；大脑中动脉闭塞；动物模型；线拴法

中图分类号：R743．3l R255．2

文献标识码：A

文章编号：1672―1349(2007)06―0511―03

在临床缺血性脑血管病中，最为常见的是火脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)引起的，因此在动物实验中也较常采用大脑中动脉闭塞的动物模型。由于大鼠的脑血管分布与人类相似，并且易存活、抵抗力强，同时便于进行动物智能测试及电生理检查，因而目前MCAO模型大都以大鼠为主。而小鼠因为其体积小、操作困难，尽管动物成本低廉，仍然使其应用受到限制。但随着医疗设备、实验器材以及技术水平的提高，已经克服了上述困难，加上转基因小鼠的日益应用，使得小鼠局灶性脑缺血／再灌注模型被广泛采用。本实验根据国外制作小鼠MCAO模型的先进经验和国内现有报道，将实验操作方法及所得经验教训简述如下，以便同行交流。

1材料与方法

1．1材料的准备　健康6周龄雄性昆明小鼠(购自山东大学西校区动物中心)40只，体重(22～25)g。2，3，5一氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazoliu chloride，TTC，上海国药集团生化公司生产)，MOTIC手术显微镜(SMZ系列)，显微手术剪刀，系结镊子，开睑器(均为六六视觉公司生产)。栓塞用线：使用蓝色6－0号单纤丝尼龙线，剪成长2cm的线段，用酒精灯将两端烧成圆球形以备用。

1．2实验方法

1．2．1动物分组　40只小鼠随机分为4组，即永久闭塞组、缺血0．5 h再灌注24h组、缺血1h再灌注24h组、假手术组，每组10只。

1．2．2模型制作　用10％的水合氯醛(350 mg／kg)将小鼠腹腔麻醉，仰卧位固定于手术台上，保持呼吸通畅。用酒精棉球擦拭颈部，在颈正中切口，钝性分离下颌下腺，显微镜下游离左侧颈总动脉，使用微血管夹夹闭。游离左侧颈外动脉，用6―0号丝线结扎其远端，在左颈总动脉分叉至前一颈外动脉结扎线之间打一松结，游离左颈内动脉并用微血管夹夹闭。用显微眼科手术剪刀在两结扎线之间剪一小口，将栓塞线向下插入至颈总动脉处，将松结扎紧，在颈外动脉远端结扎处下方、栓塞线插入的上方剪断左颈外动脉，撤离颈内动脉处的微血管夹，并使栓塞线插入端在左颈总动脉分叉处。将颈外动脉拉向外下方，使其与颈内动脉处于同一直线。将栓塞线向颈内动脉方向插入1cm左右，直至感受到阻力，为防止出血将6―0丝线扎紧。永久闭塞组此时即可将颈总动脉处微血管夹撤离，缝皮；缺血0．5h再灌注24 h组、缺血1 h再灌注24 h组即是在缺血0．5h和1h后将栓塞线和左颈总动脉处微血管夹撤出，保持动脉流畅24h。假手术组不插入栓塞线，剪断左颈外动脉后，左颈总动脉夹闭1h后撤血管夹，缝皮。术后将小鼠置于放有清洁垫料的饲养盒中，室温保持在(25～28)℃自由饮水、进食。

1．2．3神经行为学评分　术后24h，采用5 min对小鼠的神经功能缺损进行评分。0分：无神经缺损症状；1分：右前肢不能完全伸直；2分：向右旋转；3分：行走向右侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。1分～4分为有效动物缺血模型。

1．2．4脑梗死体积的计算　术后24 h断头取脑，迅速置－20℃冷冻箱中冷冻20 min后取出，在操作台上迅速由前向后行厚2．0mm的冠状切片，将切片立即置于质量分数为1％的TTC磷酸盐缓冲液中，避光37℃恒温孵育30 min。用数码相机按顺序拍摄染色后的脑片，用计算机软件(NIH Image 1．54)计算每一脑片缺血区的面积(SIN)以及双侧大脑面积(SN)，按公式A＝XSIN／XSN×100％计算脑梗死区占整个大脑体积的百分比。

1．3统计学处理　采用SPSS统计软件进行数据统计，计量资料采用t检验、配对t检验等方法；计数资料采用r2检验；等级资料采用Ridit分析。

2结果

2．1神经行为学评分(见表1)观察术后小鼠表现，经统计分析，除假手术组无明显的缺血行为表现外，其他3组均表现出神经行为学异常，为有效动物缺血模型。但经观察，缺血后再灌注的两组神经行为学改变更明显，缺血0．5h再灌注24h组比缺血1h再灌注24h组的症状出现晚。永久闭塞组的症状较缺血再灌注组出现得早，症状却轻些，存活时间长。分析可能是缺血后再灌注损伤使小鼠症状加重。假手术组偶有出现偏瘫症状者，可能与小鼠个体解剖差异有关。

2．2脑梗死体积的大小　除假手术组未见梗死灶外，其他3组均有缺血病灶，体积大小略有差异，缺血再灌注组比永久闭塞组9．6％±4．7％的梗死体积大，缺血1h再灌注24h组13．2％±6．5％比缺血0．5 h再灌注24 h组11．6％±5．9％的梗死体积稍大。经统计永久闭塞组与缺血再灌注组比较有明显差异(P

3讨论

通过实验发现，永久闭塞组虽然症状出现早，但存活时间长。缺点是不能再灌注，可能引起颈内动脉起始部位的侧支闭塞引起单侧偏盲。缺血0．5h再灌注24h组比缺血1h再灌注24h组症状出现晚，但脑切片TTC染色没有明显差异，随着再灌注时间的延长，其症状逐渐趋于一致。缺血再灌注组的存活时间比永久闭塞组短，可能是再灌注损伤造成的。假手术组基本上没有神经行为学上的表现，TTC染色也大都未见缺血病灶，存活时间也未见影响。实验证明可以通过栓塞法制造大脑中动脉闭塞的动物模型，并且效果很可靠。所以可以根据实验要求选择实验的方法，以满足课题的需要。

因为小鼠手术后的存活期和手术时间及熟练程度等有很大关系，所以本实验仅观察了小鼠手术后的生存状态及存活期限而未列出观察数据。

实验证明：不同的实验方法对小鼠的存活率、脑梗死的体积以及神经行为学的影响是不同的。手术过程中很多因素都决定着小鼠脑缺血模型是否能够成功，现将在实验过程中发现的经验教训总结如下。

3．1 麻醉是实验成功与否的关键　给予10％的水合氯醛(350mg／kg)完全能够将小鼠麻醉，麻醉程度不宜过深。小鼠在术后0．5h后能够醒来的麻醉程度是适合的。如果麻醉不完全切忌补药，容易使小鼠在手术过程中死亡。

3．2手术时间的长短是小鼠是否能长期成活的关键　手术过程中要尽量避免损伤小鼠颈部周围组织、血管、迷走神经等。尤其是迷走神经，如果麻醉过深不但不利于小鼠手术后的苏醒，在实验过程中一旦刺激迷走神经，很容易引起小鼠呼吸、心跳的停止。手术时间越短，小鼠术后的存活期越长，反之则很容易使其消瘦、不欲进食而死亡。

3．3小鼠种系、大小的选择 昆明小白鼠的生存能力是最强的，因此在前期造模实验中主要选择了昆明小白鼠。小鼠的体重以25 g左右比较合适，30 g左右的小鼠过重，脂肪多，增加了剥离血管的难度，容易引起出血。20 g以下的小鼠抵抗力差，虽然很好操作，但是难以成活。

3．4栓塞线段的处理　本实验采用进口的6―0蓝色单纤丝尼龙线，此种尼龙线经酒精灯烧制头端容易成球形，无边刺。而且可以通过控制线头球形的大小来适应所需造模小鼠血管的要求，例如小鼠大、血管粗的可以选择头端大的线段。其对应关系需要在练习时注意寻找规律。

3．5其他问题　术中要注意小鼠的体温，肛温保持在37℃左右为宜。栓塞线在插入颈内动脉时容易误插于翼腭动脉(ptery－gopalatine artery，PPA)，在反复插入时注意避免戳穿血管的问题。手术中不需结扎或切断分支小血管，尽量减少出血的可能性。颈外动脉上的松口结的松紧度要合适，松了容易引起出血，紧了会增加栓塞线进入的难度。