紫花苜蓿耐逆性状遗传与分子生物学研究进展

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇紫花苜蓿耐逆性状遗传与分子生物学研究进展范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要 有关苜蓿的耐逆性研究一直是牧草学研究的热点之一，研究领域也逐渐从形态水平发展到生理、生化及分子生物学等更深入的领域，并取得了很多有价值的研究成果。简述了紫花苜蓿耐逆性状遗传、耐逆性状分子标记、耐逆基因克隆的研究，综述了利用生物技术和诱变技术相结合的方法改良紫花苜蓿耐逆性的研究进展，旨在为紫花苜蓿耐逆育种提供参考。

关键词 紫花苜蓿；耐逆；性状遗传；分子生物学

中图分类号 S551+.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）20-0304-02

苜蓿（Medicago sativa）是世界上重要的豆科牧草，现已成为仅次于小麦、玉米、大豆之后的第四大作物，其粗蛋白含量达18%以上，干草产量可达18 t/hm2，种植一次可利用4～5年。正是因为苜蓿营养高、产量高、利用年限长的特点，因此被誉为“牧草之王”。近年来，我国苜蓿种植面积和种植区域不断扩大，西北、华北、东北各省有大量栽培，南方各地也开始栽种。对苜蓿的遗传改良一直是苜蓿遗传与育种工作者的目标。但由于栽培苜蓿的四倍体特性，且具有虫媒传粉、自交衰退的特点，使得苜蓿的遗传改良较其他作物进展缓慢。受气候和土壤的影响，紫花苜蓿在我国南方推广受到制约，对南方草食畜禽的发展产生了极大阻碍。随着分子生物学的不断发展进步，各种诱变技术和生物技术在遗传和育种方面的运用逐渐发展和提高。因此，为了推动苜蓿产业化发展，利用这些技术手段研究紫花苜蓿的耐逆性状，从而丰富我国苜蓿种质资源，并为其耐逆育种提供一定的参考。

1 耐逆遗传基础研究

1.1 耐逆遗传

国内有关紫花苜蓿耐逆性状遗传的研究不多见，因为紫花苜蓿遗传基础复杂，其是异花授粉植物，为同源四倍体，国外报道也不全面。很多植物能够在一定干旱胁迫阈值内表达相关抗旱基因，体现抗旱性[1]。湛虎[2]利用Reverse Northern技术和DDRT-PCR技术，筛选了干旱胁迫表现的基因片段，研究表明该片段可能为干旱诱导表达的新基因。目前的研究表明，基因组成决定了紫花苜蓿的抗寒性，其受到多重环境因素影响，如土壤、光照、温度等，还与秋眠性密切相关。Cunningham et al[3]以非秋眠性、不抗寒品种CUF101为亲本，在选择高秋眠性植株的同时，也提高了入选植株的抗寒性。Cunningham et al[4]研究表明，根系和根茎中Gas基因的表达和随后的脯氨酸聚积与苜蓿越冬存活率紧密相关。杨青川等[5]对紫花苜蓿耐盐性的基因效应和遗传力进行了研究，发现个体间耐盐性差异大于品种间差异，主要表现为加性效应。Al-Khatib et al[6]揭示了不同紫花苜蓿品种群体具有不同的耐盐基础，用NCⅡ杂交法研究了经耐盐选择后的遗传方差和非遗传方差。Johnson et al[7]认为，紫花苜蓿各生育阶段的耐盐机制可能不同。Campbell et al[8]研究表明通过表型轮回选择可提高紫花苜蓿对铝耐受性。

1.2 耐逆性状的分子标记

在抗寒和抗旱性方面，国内外许多学者对紫花苜蓿进行了分子标记方面的研究，如分子标记图谱构建[9]、RAPD技术引物筛选[10]、品种耐寒性检测[11]等。在耐铝毒方面，Sledge et al[12]采用RFLP技术对二倍体紫花苜蓿耐铝性进行QTL位点识别的研究，发现了2个与耐铝毒相关的基因，并定位在苜蓿RFLP图谱。在耐盐性方面，杨青川等[13]研究获得1个与苜蓿耐盐基因相连锁的RAPD标记，并推断该标记与苜蓿耐盐主效QTL紧密连锁。刘志鹏等[14]用SSR标记对耐盐和敏盐苜蓿种质群体内和群体间的遗传变异进行了研究分析。

在抗病性方面，王 瑜等[15]采用ISSR分子标记技术结合集群分离分析法对褐斑病抗性基因进行分子标记研究，初步确定了几个与褐斑病抗性基因连锁的分子标记，为建立苜蓿褐斑病的分子标记辅助选择（MAS）育种技术体系、抗病基因的定位克隆以及深入研究奠定了基础，为紫花苜蓿抗褐斑病的鉴定和分子标记辅助抗病育种提供了重要依据。

刘曙娜等[17]以筛选出的高抗寒黄花苜蓿与高产紫花苜蓿杂交产生F1代个体，并且由F1代个体自交构建F2群体。利用随机扩增DNA多态性分子遗传标记（RAPD）对F2群体进行分析。应用MAPMAKER/EXP（3.0）与JionMap4.0并结合MapDrawV2.1软件构建四倍体苜蓿遗传连锁图谱。从192个随机引物中筛选出72个引物，对94个F2个体及F1双亲DNA样本进行RAPD扩增，获得51个RAPD标记，构建了四倍体苜蓿分子遗传连锁框架图，其中包含8个连锁群，标记覆盖的基因组总长度约为1261.5 cm，标记间平均距离为24.73 cm。该图谱为构建饱和的苜蓿遗传连锁图谱提供了框架结构，并为开展苜蓿分子育种研究奠定基础。

1.3 耐逆基因克隆

紫花苜蓿耐盐碱/抗旱、抗寒能力强，目前已从紫花苜蓿中分离、克隆了多个与耐逆境相关的基因。在耐盐碱性方面，Ginzberg et al[18]从盐胁迫紫花苜蓿的根cDNA文库中成功克隆2个编码Pro的关键合成酶基因cDNA克隆。龙瑞才等[19]根据已知的与盐胁迫相关的EST序列，采用SMART RACE方法克隆了紫花苜蓿果糖—1，6一二磷酸醛缩酶（ALD）全长cDNA，命名为MsALD。结果表明，cDNA全长1 487 bp，包含一个1 194 bp的最大开放阅读框，编码398个氨基酸。经同源比对和进化树分析，MsALD基因编码的氨基酸与马铃薯、烟草、红三叶草等的果糖—l，6—二磷酸醛缩酶（ALD）氨基酸序列一致性达90%以上，确定其属第1类果糖—1，6—二磷酸醛缩酶。半定量RT-PCR分析表明，MsALD基因可能与紫花苜蓿抗盐性相关。在抗旱性方面，Bartels[20]发现，干旱胁迫诱导的乙醛糖还原酶在苜蓿中已被克隆，此种酶可减轻乙醛活化，为苜蓿抗旱育种提供了思路。在抗寒性方面，Mohapatra et al[21-22]分别从紫花苜蓿Apica品种中分离出1个受干旱、寒冷、ABA胁迫诱导的cDNA和 3个冷驯化特异性cDNA。Castonguay et al[23]从冷驯化的苜蓿根颈中分离了1个冷调节基因msaCIC。Laberge et al[24]分离了编码富甘氨酸的MsaciA。

2 诱变耐逆性

在逆境条件下，各物质的相互关系是相当复杂的。近年来植物耐逆性大多局限于逆境下生理机制的变化，缺乏各生理机制之间相关性的研究，目前引起这些作用的分子机制尚未完全研究清楚。因此，就简单的说某种物质在逆境条件下的升降，只能作为受到胁迫的参考依据。

2.1 物理诱变

李 波等[24]采用紫外线对苜蓿的愈伤组织进行诱变处理，并用PEG模拟干旱胁迫，然后对抗旱性生理指标进行测定。结果表明，脯氨酸含量、可溶性蛋白、过氧化物酶（POD）等生理指标均高于对照，趋于一致。王 瑛等[25]利用经卫星搭载的苜蓿种子诱导愈伤组织，并筛选抗羟脯氨酸变异体，获得变异细胞系，其游离脯氨酸含量高于对照2倍以上，同时对PEG和NaCl还具有交叉抗性。

在抗盐性方面，李 红等[26]对苜蓿茎段进行愈伤组织诱导，并进行NaN3和紫外线诱变处理。脯氨酸筛选后，作Na2CO3 和NaHCO3碱性胁迫，鉴定各项抗碱性生理指标，如脯氨酸含量、可溶性糖、POD等。研究结果表明，在提高苜蓿的抗碱性作用方面，2种方法均可提高苜蓿抗碱性，其中紫外线诱变效果优于NaN3化学诱变。

2.2 化学诱变

在抗旱性方面，张志胜等[27]通过3种途径利用PEG分别获得抗20%PEG带芽愈伤组织、抗20%PEG愈伤组织、抗旱性稳定的愈伤组织。在抗寒性方面，李 波等[28]利用叠氮化钠诱变3个紫花苜蓿品种幼茎诱导产生的愈伤组织，经-7℃低温筛选，发现经诱变的愈伤组织抗寒性显著提高，之后李 波等[29]用硫酸二乙酯（DES）诱变紫花苜蓿愈伤组织，也发现经DES处理后的愈伤组织抗寒力增强。继 红等[30]以EMS为诱变剂，对紫花苜蓿叶片诱导愈伤组织作低温筛选，获得了耐寒突变体。

诱变育种是植物耐逆育种的重要手段，诱变育种在组织培养中也得到了广泛的应用，应注重诱变技术与生物技术、航天育种技术相结合，加强多学科的渗透，以获得更多新成果。在分子水平上，已经实现了将一些与逆境相关的基因导入到植株体内，从而提升植株的耐逆性能。植物的耐逆性受多基因控制，存在多种调控途径并可能发生交叉，运用传统育种技术与现代分子育种技术相结合是现阶段植物抗逆育种的一个新方向。

3 参考文献

[1] 马巧利，孙彦，杨青川.苜蓿干旱胁迫的生理响应及其分子水平的研究进展[J].北方园艺，2011（14）：183-18.

[2] 湛虎.苜蓿干旱诱导相关基因的克隆和功能分析[D].长春：吉林农业大学，2008.

[3] CUNNINGHAM S M，NADEAU P，CASTONGUAY Y，et al.Raffinose and stachyose accumulation，galactynol synthase expression，and winter injury of contrasting alfalfa germplasms[J].Crop Sci，2003（43）：562-570.

[4] CUNNINGHAM S M，GANA J A，VOLENEC J J，et al.Winter hardiness，root physiology，and gene expression in successive fall dormancy selections from ‘Mesilla’ and ‘CUF 101’ alfalfa[J].Crop Sci，2001（41）：1091-1098.

[5] 杨青川，孙彦，苏加楷，等.紫花苜蓿耐盐育种及耐盐遗传基础的研究进展[J].中国草地，2001（23）：59-62.

[6] AL-KHATIB M M，MCNEILLY T，COLLINS J C.Between and within cultivar variability in salt tolerance in lucerne（Medicago sativa L.）[J].Genetic Resources and Crop evaluation，1994（41）：159-164.

[7] JOHNSON D W，SMITH S E，DOBRENZ A K.Genetic and phenotypic relationships in response to NaCl at different developmental stages in alfalfa[J].Theor Appl Genet，1992（83）：833-838.

[8] CAMPBELL T A，XIA Z L，JACKSON P R，et al.Diallel analysis of tolerance to aluminium in alfalfa[J].Euphytica，1994（72）：157-162.

[9] SLEDGE M K，RAY I M，JIANG G.An expressed sequence tag SSR map of tetraploid.Alfalfa（Medicago sativa L.）[J].Theor Appl Genet，2005（111）：980-992.

[10] 康俊梅，杨青川，樊奋成.RAPD技术分析不同抗旱性苜蓿品种DNA的多态性[J].生物技术，2005，15（6）：37.

[11] VASHUTA S，UCHIYAMA K，ISOBE S，et al.Some approaches for use of RAPD analysis in the tetraploid outcrossing alfalfa Source Utilization of transgenic plant and genome analysis in forage crops[R].Proceedings of an international workshop held at the National Grassland Research Institute.Japan：Nishinasuno，Tochigi，1998：143-148.

[12] SLEDGE M K，BOUTON J H，DALL’AGNOLL M，et al.Identification and confirmation of aluminum tolerance QTL in diploid Medicago sativa[J].Crop Science，2002（42）：1121-1128.

[13] 杨青川，韩建国.紫花苜蓿耐盐分子标记的初步鉴定[J].中国农业科学，2005，38（3）：606-611.

[14] 刘志鹏，杨青川，呼天明，等.用SSR标记研究不同耐盐特性四倍体紫花苜蓿的遗传多样性[J].作物学报，2006，32（4）：630-632.

[15] 王瑜，袁庆华，高建明.苜蓿褐斑病抗性基因ISSR标记研究[J].中国草地学报，2008，30（3）：65-68.

[16] CASTONGUAY Y，LABERGE S，NADEAU P，et al.A cold-induced gene from Medicago sativa encodes a bimodular protein similar to deve-lopmentally regulated protein[J].Plant Molecular Biology，1994（24）：799-804.

[17] 刘曙娜，于林清，周延林，等.利用RAPD技术构建四倍体苜蓿遗传连锁图谱[J].草业学报，2012，21（1）：170-175.

[18] GINZBERG I，STEIN H，KAPULNIK Y，et al.Isolation and charac-terization of two different cDNAs of 1-pyrroline-5-carboxylate synthase in alfalfa，transcriptionally induced upon salt stress[J].Plant Molecular Biology，1998，38（5）：755-764.

[19] 龙瑞才，杨青川，康俊梅，等.紫花苜蓿果糖-1，6一二磷酸醛缩酶基因全长克隆及分析[J].西北植物学报，2010，30（6）：1075-1082.

[20] BARTELS D.Targeting detoxification pathways：an efficient approach to obtain.plants with multiple stress tolerance[J].Trends Plant Sci，2001（6）：284-286.

[21] MOHAPATRA S S，POOLE R J，DHINDSA R S.Abscisic acid-regulated gene expression in relation to freezing tolerance in alfalfa[J].Plant Physiol，1988（87）：468-473.

[22] MOHAPATRA S S，WOLFRAIM L，POOLE R J，et al.Molecular cloning and relationship to freezing tolerance of cold-acclimationspecific genes of alfalfa[J].Plant Physiol，1989（89）：375-380.

[23] LABERGE S，CASTONGUAY Y，VEZINA L-P.New Cold- and Drought-Regulated Gene from Medicago sativa[J].Plant Physiol，1993（101）：1411-1412.

[24] 李波，贾秀峰，焦德志，等.紫外线诱变苜蓿愈伤组织抗旱性的研究[J].干旱地区农业研究，2005，23（6）：103-105.

[25] 王瑛，牛炳韬，贾敬芬.苜蓿培养细胞抗羟脯氨酸变异体的筛选和特性分析[J].环境生物学报，1998，4（4）：340-344.

[26] 李红，李波，赵洪波，等.诱变处理苜蓿愈伤组织抗碱性的研究[J].草业科学，2009，26（7）：32-35.

[28] 李波，贾秀峰，高美玲.诱变苜蓿耐寒突变体的研究[J].草地学报，2004，12（2）：95-97.

[27] 张志胜，赵世绪.渗透胁迫下苜蓿愈伤组织的生长和植株再生[J].植物生理学通讯，1995，31（1）：21-23.

[28] 李波.硫酸二乙酯诱变苜蓿愈伤组织耐寒生理的研究[J].草业科学，2004，21（5）：20-22.

[30] 继红，杨文杰，李淑云.紫花苜蓿耐寒突变体的筛选[J].东北师大学报：自然科学版，1996（2）：84-87.