基于电容的牛奶体细胞含量检测方法研究
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摘 要：本文以随机采集的新鲜牛奶为研究对象，测取牛奶的电容、温度和体细胞数，建立了用电容和温度来预测体细胞含量的神经网络模型，模型对N、T、1、2级奶样的预测正确率分别为：63.33%、55.55%、85.00%、91.66%。结果表明，牛奶电容的变化与体细胞的含量变化有密切的关系，细胞浓度越高检测的准确度就越高。
关键词：牛奶；电容；体细胞；检测方法
中图分类号：TS252.7 文献标识码：A
新鲜牛奶中的体细胞数量（somatic cell count，简称SCC）与奶牛乳腺炎、牛奶质量密切相关。通常用每毫升牛奶中的体细胞数表示，体细胞含量已被许多国家当作监控牛群健康状况，牛奶质量和牛奶收购定价的重要指标[1]，如何实现牛奶中体细胞的准确快速检测具有重要的意义。
在众多的体细胞检测方法中，电检测方法最为快捷方便，郭庆[2]等多人研究了牛奶电导率与体细胞含量的关系。
但是很少有人从细胞电容的角度研究电容值的大小与细胞含量的关系，事实上，Xiong Z Q等研究了发酵过程中，生物量与电容之间的关系，并发现两者之间存在线性关系[3]，这是因为细胞和细菌的膜是由电导率极低的双层磷脂分子构成的，当完整的细胞和病菌处于电场中时，膜内的离子在电场力作用下移动到细胞膜表面时将受电导率极低的膜的束缚而停留。电荷在细胞膜表面积累使细胞膜充电，细胞就成为一个微小的电容器，细胞越多，电容越大[4]。
本文通过测取不同细胞含量的新鲜牛奶样品的电容值和牛奶温度，建立起预测体细胞含量的神经网络模型，以期达到最终应用于快速准确检测牛奶质量，诊断奶牛炎的目的。
1 材料与方法
1.1 主要仪器设备
日本HIOKI3532-50 LCR测试仪；BCD-219SKDE冷藏柜；高精度的温度计（精度为0.01℃）；培英THZ-C恒温振荡器；奥林巴斯CX21生物光学显微镜。主要数据分析处理软件采用Matlab 7.3 （The Math Works Inc.， Natick， MA）软件。
1.2实验方法
1.2.1奶样采集
奶样采自100多头同一品种黑白花奶牛。采样时先用温开水擦洗，后用75%的酒精对进行消毒，并用干净的纸巾擦干，再弃去前两次挤出的牛奶，然后进行奶样采集。每个乳区的牛奶分别挤入50mL的干净编号玻璃瓶内密封。在运输过程中放入有冰袋的隔热泡沫塑料盒进行保鲜。最后将当天采集的奶样带回实验室测试，来不及马上测试的奶样需4℃冷藏保存，防止牛奶变质而影响测试效果。
1.2.2细胞含量测定
牛奶中体细胞的含量测定采用改进的显微镜直接计数法，即，碘酊染液染色，细胞计数板计数。奶样带回实验室后，将盛有奶样的奶样瓶放入恒温振荡器，在40℃的恒温下缓慢震荡20min后取出，使得细胞均匀的悬浮在牛奶中，再用移液枪吸取0.1mL的奶样注入编号的试管内，再用移液枪吸取1.9mL碘酊染液注入试管内，轻轻摇动，混合均匀，静置3～5min。再用移液枪吸取少量染色后的奶样（约半滴）轻轻接触盖玻片和计数板的结合处，任其自动流入并充满计算室，后进行显微镜计数，在目物镜15×40的放大倍数下，将计算室四角4个大方格内的全部体细胞按顺序计数，为避免重复和遗漏，规定对压在方格左边和上边线上的体细胞均计在本格内。压在右边和下边线上的体细胞则不计在内，即“数上不数下，数左不数右”。最后，牛奶的体细胞含量按公式（1-1）计算
SCC=T×5×104 （1-1）
（1-1）式中：
SCC——牛奶中每毫升的体细胞含量（个/mL）
T ——四角4个大方格内（每个大方格有16个小方格）的体细胞数目之和
实验中，同一个奶样重复镜检计数4次，取其平均值作为最终的牛奶体细胞含量，共测取了80份奶样。并根据细胞含量和加利福尼亚CMT标准，将奶样划分到5个不同的等级，见表1[5]。
1.2.3牛奶电容测量
因为温度对牛奶电容的影响也较大，电容测量时需要测量和记录被测奶样温度，再将奶样注入电极片面积是5mm×5mm、长度为10cm的平板铂金电极池内。最后用HIOKI3532-50 LCR测试仪测量记录奶样的电容值。测完一个奶样后，注射器和电极都必须用蒸馏水洗净，并用一定量的下一个奶样冲洗3次，再进行下一个奶样的测试。所有的样品都在采集后的12h内全部测试完毕。
BP（back propagation）算法是目前应用最为广泛的神经网络学习算法，可以实现输入和输出间的任意非线性映射，且具有一定的泛化功能[6]。将乳汁的温度和电容2个向量作为网络的输入，输入层神经元数为2。网络的输出向量为体细胞数，输出层神经元数为1。该网络采用了2个隐层。两隐层之间传递函数为tansig，输出层函数为Purelin，训练函数也选用trainlm。在网络训练前，将数据用mapstd（）标准化函数进行了标准化预处理，以避免数据饱和并加速网络的收敛。
通过调整隐层的节点数和相关的训练参数对网络结构进行了优化试验。经过多次的训练仿真，发现当最大迭代次数为10000，误差性能目标值为0.1。网络模型的两隐层神经元数为6和4时结果较为满意，模型结构为2-6-4-1，如图1所示。
2.1模型分析
模型的评价指标和预测结果见表2、3和图2、3。由表2可知，模型的相关性很高，相关系数R达到了0.9847；预测集的预测相关系数Rp也达到了0.9862。均方根误差稍大，模型均方根误差RMSE为15.5644；预测均方根误差RMSEp别为10.5421。由图2可以看出，模型的决定系数也较高，R2为0.9896，以上说明所建立的奶牛乳腺炎的检测模型是基本满意的。
2.2模型预测结果与分析
由图3可以看出，模型的预测决定系数R2为0.9926。表3中，模型对9个建模后剩余的奶样（每级10%的和）进行了预测，正确预测检出率为88.88%；80个奶样的总体检出率为72.5%；各级奶样总数的检出率上，N级和T级的正确检出率偏低，分别为63.33%和55.55%。但是1级和2级的正确检出率明显的大幅度提高，分别达到了85%和91.66%。导致这种结果的原因，很可能在于体细胞的含量上，在N级和T级中，测试奶样的体细胞含量最高不会超过400，000/mL，而绝大部分奶样属于N级，体细胞数不高于200，000/mL，这样总体上细胞的浓度就比较低，因此细胞所产生的电容信息就比较少，在干扰信号的影响下，信息可能就会被淹没，最终导致了N级和T级的检出率较低。一般在测量频率较低时，溶液中细胞表现出的电容要远小于电极的界面极化电容[7]。所以N、T级奶样的细胞极化电容与电极极化的界面电容相比较是比较小的，细胞含量的差异也就不能很好的从测取的电容上反应出来。另外T级正确检出率略低于N，可能是T级的奶样数目较小所致。1级和2级的正确检出率较高，可能是体细胞的浓度较高，细胞产生的电容信息较多，这时电容的大小就能很好的反映体细胞的数量，而细胞含量越高，这种关系就会越明显，而2级中的奶样体细胞的含量不低于1，200，000/mL，所以正确的检出率，就达到了91.66%。
3 结论
牛奶中细胞电容与细胞含量有密切的关系，细胞的浓度越高指标的衡量效果就越好。但在较低细胞浓度下关系不明显，进一步深入研究如何提高细胞电容的检测精度是一个重要的研究课题。
参考文献
[1] C. B.Malek dos Reis， J. R.Barreiro，J. F.G.Moreno，etal. Evaluation of somatic cell count thresholds to detectsubclinical mastitis in Gyr cows [J]. J Dairy Sci， 2011， 94 ：4406-4412.
[2]郭庆，王鲁，朱伟等.牛乳电导率值与体细胞数相关性的研究[J].贵州畜牧兽医，2009，33（5）：1-3.
[3] Xiong Z Q， Guo M J， Guo Y X， et al. Real-time viable-cell mass monitoring in high-cell-densit fed-batch glutathione fermentation by saccharomyces cerevisiae T65 in industrial complex medium [J]. J Biosci Bioeng， 2008， 105（4）：409-413.
[4] Claes JE， Van Impe JF. On-line estimation of the specific growth rate based on viable biomass measurements： experimental validation.[J]Bio-proc Biosyst Eng 1999，21：389-395.
[5]刘峰， 迟玉杰.炎乳的检测方法[J].现代食品科技， 2005， 21（1）：129-131.
[6] Cavero D， Tlle K H， Henze C， et al .Mastitis detection in dairy cows by application of neural networks [J].Livestock Science， 2008， 114：280-286.
[7] Shramik Sengupta，David A. Battigelli and Hsueh-Chia Chang. A micro-scale multi-frequency reactance measurement technique to detectbacterial growth at low bio-particle concentrations[J].Lab on a Chip， 2006， 6：682-692.
作者简介：崔传金（ 1982- ），男，汉族，讲师，工学博士，研究方向：生物传感器，测控技术与智能仪器。