组织工程生物反应器的研究进展
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【中图分类号】R318.0【文献标识码】A【文章编号】1007-8517 (2010) 02-015-2
组织工程是指用工程科学和生命科学的原理和主法,制备组织和器官替代物,以恢复、维持或改善人体组织、器官的功能,是一个发展迅速、意义深远的生物医学工程应用领域。而目前,骨组织是仅次于血液的第二大移植物,正需要与组织工程学结合,解决大量需求的问题。阻碍骨组织工程发展和临床应用的主要因素至少包括两点:(1)对调控组织的功能化培养的物理-生物化学因素知之还少;(2)高昂的生产成本和缺乏商业化的功能性组织工程产品。而解决上述问题,组织工程生物反应器的角色至关重要。组织工程生物反应器与细胞规模化扩增,细胞在基质上高密度、均匀化生长,营养物的供给和代谢物的移除等重要物质传递过程式,以及对细胞所施加的力学刺激密切相关。它一方面可成为研究组织细胞培养的不同环境因素如何影响特定细胞、组织的三维功能化培养的重要技术手段,另一方面它是改进功能化组织质量、降低生产成本的关键之一;同时它也是组织工程从实验到标准的工业化、规模化生产,到临订应用过程中的一个关键环节。目前应用于骨组织工程的生物反应器主要有搅拌式生物反应器、灌注式生物反应器和旋转壁式生物反应器三大类。本文将就以上三种反应器的力学环境、细胞接种和传质作用综述如下:
1力学环境
在生理状态下,骨组织为适应机体活动所需的物理支持而在不断的改建和塑形,以满足不同个体对动作或姿势的特殊需求,当骨组织长期失去正常的力学刺激,骨骼可出现明显的脱钙、疏松。在体内,成骨细胞所处的这种力学环境极为复杂,而在体外细胞培养的基础上力学刺激通常分为压应力系统、张应力系统、流体剪切应力系统和离心力培养系统。
1.1搅拌式生物反应器
其主要原理是通过叶轮或是浆式搅拌器搅动培养液从而提供传质能力,为细胞培养提供一定的氧浓度和均匀的养分分布的环境,有利于细胞保持天然形态,并维持其新陈代谢在正常的生理范围。但由于是通过搅拌,使培养液中的切应力较大,从某种意义上来说这是不适合组织工程式细胞和组织的培养。所以如何减少搅拌时的剪切应力,成为搅拌式生物反应器性能提高的重要环节。而剪切破坏主要原因是气泡的破裂,故避免大气泡的产生非常重要。在骨组织工程中,搅拌式生物反应器主要应用于细胞与支架的复合。配合微载体、多孔微球、灌注技术,可达到更好的细胞培养效果。谭昌月等人[1]曾在搅拌式生物反应器中采用Cytoporel多孔微载体和无血清培养基DF5S连续灌流培养CHO工程细胞株4B3来生产重组组织型纤溶酶原激活剂,实现了高密度长期培养4B3细胞,有效地保证了重组组织型纤溶酶原激活剂生产的质量一致性。
1.2灌注式生物反应器
灌注式生物反应器是通过培养液的循环灌注,从而可以对所培养的细胞施加流体剪切力、静态压缩力等应力刺激。Glowacki J等[2]发现在体外培养尺寸较大的支架时,应用灌注式生物反应器将培养液灌注到三维多孔支架内部,能够增强细胞的活性和功能。Goldstein AS等人[3]发现应用灌注式生物反应器以特定流速培养细胞时能够促进细胞的生长、分化。Gomes ME等人[4]发现应用灌注式培养器可以促进骨髓基质细胞的钙基质的沉积。但是对于不同空间结构的三维多孔支架,必然要不同的灌注速率,什么样的速率是最优的、最有利于细胞生长的,有必要使用专业的流体力学分析软件 (如FLUENT) 来对不同结构的支架进行预先分析和模拟。得到一些比较有价值的数据,可以分析细胞所受剪应力的大小等。
1.3旋转壁式生物反应器
旋转壁式生物反应器(rotating wall vessel bioreactor,RWVB)是水平旋转、 无气泡的膜扩散式气体交换的培养系统。细胞通过膜式气体交换器来吸氧和排出CO2,任何气泡都会被清除,消除了旋涡对细胞的生长的影响。悬浮细胞和微载体珠粒上的贴壁细胞在水平的旋转式细胞培养容器内产生一个均匀的、极低剪切力的液体悬浮轨道,随着细胞的长大,可调节旋转的速度来抵偿沉降速率。由于该系统无推进器、空气升液器、气泡或搅拌器,细胞颗粒不与容器壁或任何其它易致伤的物体相碰,故几乎没有破坏性的剪切。有别于其它生物反应器,RWVB中培养液的驱动是以其本身的重力及液体与筒壁的相互作用产生。它不同于机械搅拌,气液推动等传统驱动模式,较好地减少了机械剪切和气泡,满足了组织工程中对细胞的剪切力应充分小的要求,因此RWVB培养细胞更接近自然条件下生长的细胞[5,6,7]。另外,当RWVB水平运转时,在浮力、离心力、培养液带动的共同作用下,培养物在RWVB中的特定位置可处于微重力环境,有利于其本身的三维生长,使三维组织成型更加容易。旋转生物反应器具有低剪应力特征[8,9,10],可提供非破坏性的低剪应力 (
2细胞接种
细胞与支架黏附并组织化是组织构建的重要环节和必要条件。研究表明,种子细胞接种的密度及其在支架中的分布对于种子细胞的增殖、分化和迁移产生重要影响,并最终影响组织工程化组织的质量[12,13]。与以往静态的接种方法相比,动态接种方法能明显提高种子细胞的接种效率,获得较高的接种密度和在支架内的均匀分布[14]。近年来,研究者通过不断改进生物反应器的性能,在改善培养环境的同时,也明显提高了种子细胞的接种效率。搅拌瓶生物反应器中,种子细胞悬浮于培养液中被不断搅拌,与支架材料接触。种子细胞首先黏附于支架材料表面,继而迁移至支架内部。这种接种方法使种子细胞在支架内分布不均,支架表面种子细胞密度高,而支架内部种子细胞密度却较低。与搅拌瓶生物反应器中产生的涡流相比,旋转壁生物反应器所引起的液流方式为层流,这种液流方式在减少流体剪切力的同时,明显提高了种子细胞的接种密度,并使其在支架内的分布更加均匀。Carrier等[15]在实验中通过比较,观察到旋转壁生物反应器的接种效率比搅拌瓶生物反应器提高23%,而对细胞的损伤却减少了20%。直接灌注式生物反应器将培养液通过泵加压方式直接注入支架材料中,使悬浮于培养液中的种子细胞随液流进入组织块内部,与静态接种和搅拌瓶接种相比,不仅接种效率高,在支架内的分布也均匀[16]。
3传质作用
3.1搅拌式生物反应器
搅拌式生物反应器提高的培养液中的氧浓度,可使培养液中的营养成分均匀分布。Nilsson K等人研究表明,搅拌式生物反应器的培养液营养物质的传递明显优于静置培养组[17]。但是由于力学因素的作用,使搅拌式生物反应器并不适于组织细胞的培养。
3.2灌注式生物反应器
灌注式生物反应器具有较高的传质效率,因而增强了细胞的增殖、分化能力和功能表达。Freed LE等[18]认为灌注式生物反应器可确保种子细胞在载体中心的均匀分布,为载体内种子细胞的增殖提供必要的营养物质和氧气,实现细胞周围有效的气液交换。Goldstein等[19]研究表明灌注型生物反应器培养下的细胞复合效率和功能优于转瓶式和旋壁式生物反应器。然而由于灌注式生物反应器的传质作用主要是靠分子的渗透作用,目前设计的生物反应器仅适用于数毫米载体的构建,对于超过一定厚度的培养组织,难以进行营养渗透,构建的组织仍不能满足修复重建大段骨缺损的需要。但应用灌注式生物反应器便于施加其它的力学刺激,从而改善培养液在细胞间的流动[20]。传质的效率与流量有直接关系,流量又与支架材料的孔隙率及流体的黏度和流速有关。过高的流速虽然增加了流量,但同时产生了过高的流体剪切力,不利于种子细胞的黏附和细胞外基质的沉积。理想的灌注式生物反应器应把握好传质作用、流体剪切力及细胞和细胞外基质驻留三者之间的平衡[21]。
3.3旋转壁式生物反应器
由于旋转壁式生物反应器有很好的物质交换功能,细胞在RCCS 中能以很高的密度生长,其组织的培养密度为1010～1011个细胞/ml,细胞的培养密度为108,故可快速大规模地培养细胞。此外,RCCS是目前唯一能使研究者进行共同培养的生物反应器,而这种培养能提供本能的分化、高细胞增殖、低的细胞死亡率和增加细胞产物的分泌。在悬浮状态下,细胞营养混合更均匀,细胞生长状况均一,不会产生局部的副产物积累,因而细胞生长速率快,从而可获得更多细胞。旋转壁生物反应器培养的组织块在生物化学和生物机械性能方面均优于静态培养和搅拌瓶[22]。
4展望
随着骨组织工程学研究的深入和发展,生物反应器必然会拥有越来越广泛的用途,也必然会受到越来越多的重视。而它的发展,反过来也必然会带动骨组织工程的进一步发展。目前,生物反应器在组织工程中的应用仍主要停留在细胞或组织培养的某个阶段。目前存在的生物反应器仍具有以下不足:1、操作繁琐,易于污染。2、能够施加的影响因素单一,距体内的环境相去较远。3、智能化、规模化程度低,难以满足大量的临床需求。4、多是单一研究应用,未能形成产业化发展。随着活体内生物环境的进一步探明、生物仿生学的发展、人工智能的开发,以及工程科学的进步。骨组织工程生物反应器将会进一步实现仿生环境的模拟、智能化的调控、产业化的生产。
参考文献
[1] 谭昌月.用喃乳动物生产人用治疗制剂的发展与改进[J].国外医学(预防、诊断、治疗用生物制品分册)2001,24.