秦美猕猴桃高频遗传转化再生体系的建立

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摘要：以秦美猕猴桃茎段为外植体，在原代培养成功获得无菌试管苗的基础上，进行愈伤组织诱导培养。将获得的秦美猕猴桃愈伤组织转入再分化培养基中，采用正交设计试验，添加不同种类及不同浓度的植物生长调节物质，组成９种不同的再生植株分化培养基，对秦美猕猴桃愈伤组织进行再分化培养。结果表明，诱导培养基中添加１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ暗培养，有利于秦美猕猴桃愈伤组织的形成，诱导率达１００．０％；再分化培养基中添加３．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．1 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋５０ ｇ／Ｌ蔗糖，能明显提高秦美猕猴桃愈伤组织再分化率。这种方法把诱导愈伤组织与再分化分开进行，可以获得更多的愈伤组织进行再分化培养基的优化，也有利于进行秦美猕猴桃的遗传转化研究。

关键词：秦美猕猴桃；组织培养；愈伤组织；再分化

中图分类号：Ｓ６６３．４；Ｑ８１３文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）14－2993-02

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｗｉｆｒｕｉｔ （Ｑｉｎｍｅｉ）

ＹＵＡＮ Ｙｕｎ－ｘｉａｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｅｉｎａｎ Ｔｅａｃｈｅｒｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｉｎａｎ ７１４０００，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｔｅｍｓ ｏｆ Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｄｅｌｉｃｉｏｓａ ｃｖ． Ｑｉｎｍｅｉ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｃａｌｌｕｓ ａｆｔｅｒ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｇａｉｎｅｄ ａｓｅｐｔｉｃ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｃａｌｌｉ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｐｌａｃｅｄ ｏｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｓｕｃｈ ａｓ ６－ＢＡ ａｎｄ ＮＡＡ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｃｏｍｐｏｓｅ ｔｈｅ ９ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ Ｌ９（３４） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｄｄｉｎｇ １.0 ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ ａｎｄ ０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ ｉｎ ｄａｒｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｔｏ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， ｏｎ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｒａｔｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｓ ｈｉｇｈ ａｓ １００％． Ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ＭＳ＋ ３．０ ｍｇ／Ｌ ６ＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋50 g/L ｓｕｃｒｏｓｅ； ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｈｏｏｔｓ． Ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｈｏｏｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｉｓ method; and more callus could be obtained for further study； thus was advantageous to kiwifruit genetic transformation.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｋｉｗｉｆｒｕｉｔ； ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｃａｌｌｕｓ； ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ

猕猴桃是雌雄异株植物，倍性复杂，杂交育种周期长［１］。因此，组织培养技术已成为猕猴桃快速繁殖的重要途径［２］。在组织培养过程中，不同种类植物生长调节剂以及同一种植物生长调节剂的不同浓度都会影响猕猴桃愈伤组织植株的再生［３－５］。开展不同植物生长调节剂对猕猴桃愈伤组织植株再生的影响研究，有利于筛选出一种高效快速的猕猴桃愈伤组织植株再生方法，为猕猴桃大规模生产、遗传转化及品种改良研究奠定基础。

１材料与方法

１．１材料

以西安市长安区优质栽培的秦美猕猴桃的一年生带腋芽枝条为试验材料。

１．２方法

１．２．１秦美猕猴桃无菌苗原代培养剪取秦美猕猴桃一年生带腋芽枝条的新嫩枝，用自来水冲洗附着的泥土、灰尘等杂物，放入烧杯中，加入适量洗衣粉，再在自来水下冲洗约２ ｈ后，再用去离子水冲洗５ ｍｉｎ，于超净工作台内，先用体积分数为７５％的酒精处理３０ ｓ，再用１ ｇ／L升汞处理１２ ｍｉｎ，然后用无菌去离子水冲洗５～６次，切成约１．０～１．５ ｃｍ的带节茎段作外植体，接种于ＭＳ基本培养基（不添加任何激素，附加３０ ｇ／Ｌ蔗糖及8 ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ值为５．８）上，进行原代培养。

１．２．２秦美猕猴桃愈伤组织的诱导待秦美猕猴桃原代无菌苗长至３～５ ｃｍ时，在超净工作台内，将嫩苗的茎段剪成１ ｃｍ左右接种于不同的诱导培养基上。以ＭＳ＋３０ ｇ／Ｌ蔗糖＋8 ｇ／Ｌ琼脂作为基本成分，分别添加６－ＢＡ ０．０、０．５、１．０、１．５、２．０ ｍｇ／Ｌ和ＮＡＡ ０．０、０．１、０．２ ｍｇ／Ｌ，组成１５种诱导培养基，在２４～２６ ℃条件下暗培养，诱导愈伤组织形成，３周后统计诱导率，并观察愈伤组织生长状态。

１．２．３秦美猕猴桃愈伤组织的再分化诱导培养３周后，将结构致密、淡黄绿色愈伤组织小心切下，分别接种于不同的再分化培养基上。每瓶接种５块组织，培养温度（２５±１）℃、光照强度１ ５００～２ ０００ ｌｘ、每天光照时间１３ ｈ。分化培养基的筛选采用正交设计Ｌ９（３４）［６］，设置３个因素分别为６－ＢＡ、ＮＡＡ、蔗糖，每个因素设置３个水平（表１）。每个试验３次重复。

２结果与分析

２．１无菌苗原代培养

秦美猕猴桃一年生带腋芽枝条的茎段原代培养２周左右，从节段处长出３～５ ｃｍ长新的嫩苗。此嫩苗后期生长较快，加上培养基中无需定期加水培养，减少了污染的机会，此外，在材料不充分的条件下，这是一种高效的外植体快繁的好方法。

２．２不同浓度６－ＢＡ和ＮＡＡ对秦美猕猴桃愈伤组织诱导的影响

以无菌苗茎段为外植体进行暗培养，１周左右就能在茎的两端开始看到愈伤组织，质地致密，颜色淡黄绿。从表２可以看出，培养基中没有添加任何植物生长调节剂的培养组合，不能诱导出愈伤组织。在添加０．５～２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ时，愈伤组织诱导率相应提高，添加１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ时诱导率达１００．０％。而当只添加０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ时，诱导率为７０．８％，同时附加６－ＢＡ和ＮＡＡ时，诱导率有所提高，诱导率最高、愈伤组织质地好且调节剂用量较合适培养组合是添加１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ的培养基。

２．３不同因素对秦美猕猴桃愈伤组织再分化的影响

在按照正交设计的Ｌ９（３４）秦美猕猴桃愈伤组织再分化培养基中，秦美猕猴桃愈伤组织都能不同程度地分化出再生苗（表３）。从表３直观分析得出，适宜再分化的培养基为ＭＳ＋３．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．1 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋５０ ｇ／Ｌ蔗糖，影响最大的为６－ＢＡ，其次为ＮＡＡ，最小为蔗糖。通过方差分析可以看出，６－ＢＡ各水平间差异极显著，而ＮＡＡ和蔗糖各水平间的差异不显著（表４）。用再分化培养基ＭＳ＋３．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．1 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋５０ ｇ／Ｌ蔗糖进行愈伤组织再分化培养确认试验，在再分化培养３５ ｄ后进行统计，再分化率可达到８６％左右，再生苗生长正常。因此，可以确定秦美猕猴桃愈伤组织再分化培养基为ＭＳ＋ ３．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．1 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋５０ ｇ／Ｌ蔗糖。

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３讨论

秦美猕猴桃愈伤组织诱导时，培养条件采用暗培养，愈伤组织诱导率较高而且有利于愈伤组织的再分化，这与毕静华等［７］的研究相一致。植物生长调节剂是影响愈伤组织再分化的关键性因素之一。ＺＴ和６－ＢＡ都是诱导猕猴桃愈伤组织再生植株时常用的细胞分裂素［８］，但由于ＺＴ价格较贵，６－ＢＡ是比较实用的，它完全可以替代ＺＴ。同时由于ＮＡＡ和６－ＢＡ有协同作用，这与葛新玲等［９］的报道一致。试验在获得原代无菌苗的基础上，用原代苗茎段作为外植体进行秦美猕猴桃愈伤组织诱导。再将秦美猕猴桃愈伤组织转入分化培养基中分化培养，而不是在诱导愈伤组织的同时直接就进行芽的诱导，这种方法可以获得更多的愈伤组织进行再分化培养基的优化，也有利于进行秦美猕猴桃的遗传转化研究。

参考文献：

［１］ 秦永华，张上隆，朱道圩，等． 猕猴桃的组织培养和遗传转化研究进展［Ｊ］． 细胞生物学杂志，２００４，２６（１）：５７－６１．

［２］ 文国琴，石大兴，吴雪梅，等． 猕猴桃组织培养研究的现状与进展［Ｊ］． 北方果树，２００４（３）：１－４．

［３］ ＨＩＲＳＣＨ Ａ Ｍ，ＴＥＳＴＯＬＩＮ Ｒ． Ｅｍｂｒｙｏ ｒｅｓｃｕｅ ｆｒｏｍ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｒｏｓｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ａｃｔｉｎｉｄｉａ （Ｋｉｗｉｆｒｕｉｔ）［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２００１，２０（６）：５０８－５１６．

［４］ 田娜，徐子勤，何近刚． 猕猴桃高频直接再生体系的建立［Ｊ］． 武汉植物学研究，２００７，２５（１）：７９－８３．

［５］ 王大平． 不同浓度的激素组合对猕猴桃愈伤组织诱导及芽分化的影响［Ｊ］． 安徽农业科学，２００７，３５（３６）：１１７６１，１１８２１．

［６］ 方开泰，马长兴． 正交与均匀试验设计［Ｍ］． 北京：科学出版社，２００１．

［７］ 毕静华，刘永立，ＳＹＥＤ Ａ． 阔叶猕猴桃叶片离体器官发生和植株再生［Ｊ］． 果树学报，２００５，２２（４）：４０５－４０８．

［８］ ＨＡＲＡＤＡ Ｈ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｏｒｇａｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ＰＬ． ａｓ ａ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｊ Ｈｏｒｔ Ｓｃｉ，１９７５，５０：８１－８３．

［９］ 葛新玲，朱立武． 猕猴桃高效离体再生体系的研究［Ｊ］． 中国农学通报，２００８，２４（１０）：３７３－３７６．

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文

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