丹星通络汤对脑缺血再灌注大鼠Caspase-3表达的影响

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(大连医科大学第二附属医院中医科，辽宁大连116027)

摘要：目的：观察丹星通络汤对大鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞Caspase-3蛋白表达的影响，探讨其神经保护作用机制。方法：40只健康雄性Wistar大鼠，采用大脑中动脉线栓法建立局灶脑缺血再灌注大鼠模型，并随机将大鼠分为假手术组(sham)、缺血再灌注组(Ⅰ/R)、丹星通络汤大、小剂量组和尼莫地平组，每组8只。丹星通络汤组分别按15mL/kg(大剂量)，7.5mL/kg(小剂量)，尼莫地平组10mL／kg，术前连续灌胃给药7天，每天1次。假手术组和缺血再灌组分别灌以10mL/kg的生理盐水。大鼠局灶性脑缺血2h，然后进行再灌注。在再灌注24h断头取脑组织，采用免疫组织化学法检测脑组织中caspase-3蛋白的表达，并与病理组织学改变进行对照。结果：丹星通络汤能明显降低大脑皮质及海马Caspase-3的表达，减轻神经细胞损伤。结论：丹星通络汤能减轻脑组织的缺血再灌注损伤，改善神经功能缺失，其作用机制可能与抑制Caspase-3蛋白表达有关。

关键词：脑缺血再灌注损伤；Caspase-3；大鼠；丹星通络汤

中图分类号：R285.5　文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)05－1021－03

既往研究证明，脑缺血再灌注后缺血中心区的神经元死亡以坏死形式为主，而半暗带区的神经元死亡与凋亡有关。Caspases家族是一组高效蛋白水解酶，与细胞凋亡密切相关，其中Caspase-3是最关键的效应蛋白酶。丹星通络汤主要由黄芪、三七、丹参、胆南星等组成，具有益气活血功效，是临床治疗缺血性脑血管病及其后遗症的有效方剂。本实验以缺血一再灌注后神经元Caspase-3蛋白表达情况作为主要观察指标，探讨丹星通络汤的脑保护作用，旨在为缺血性脑卒中患者的治疗提供有效的药物。

1材料与方法

1.1动物及分组　健康雄性Wistar大鼠40只(大连医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK辽2002-0002)，月龄3～4个月，体重250～300g，随机分为假手术组、模型组、丹星通络汤大剂量组、丹星通络汤小剂量组、尼莫地平组，每组8只。

1.2药物　丹星通络汤原方由黄芪、三七、丹参、川芎、胆南星等药组成，由大连医科大学第二附属医院中药局提供，经水煎制备成浓缩剂，生药浓度为1g/mL；尼莫地平由山西亚宝药业集团股份有限公司生产，产品批号：050316，每片20mg；Caspase-3(1:150)试剂及免组化试剂盒均购于福州迈新生物技术有限公司。

1.3局灶性脑缺血再灌注模型的建立　用Zea-longa颈外动脉线栓法：3.5％水和氯醛(0.35g/kg)腹腔注射麻醉，暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，分离电凝ECA的甲状腺上动脉、枕动脉分支。远端结扎ICA的翼腭动脉分支。动脉夹夹闭CCA、ICA、ECA远端，将在肝素中浸过并经火焰将一端烤成圆球状的尼龙线(直径约0.28mm)经ECA插入ICA约18～22mm，直至有阻力感，即到了MCA起始部。结扎ECA远端丝线，逐层缝合，使丝线暴露于体外约1cm。缺血2h后拔除丝线直至有阻力感，说明丝线已离开ICA而位于ECA内，将体外丝线剪断。动物出现左侧Homer征，提尾右前肢屈曲或行走向右划圈者入选，对无神经损伤症状或术后2～3h不能自发行走且意识丧失及死亡者均剔除。术中肛温控制在36.5～37.5℃。

1.4给药　各治疗组采用灌胃法，在脑缺血再灌注模型制成前将制备的水煎液(生药含量为1g/mL)及尼莫地平片溶于蒸馏水制成的混悬液，分别以15mL/kg(中药大剂量组)，7.5mL/kg(中药小剂量组)，10mL/kg(尼莫地平组)，术前连续给药7天，每天1次。最后一次灌胃后30min实施脑缺血再灌注手术。假手术组和缺血再灌组分别灌以10mL/kg的生理盐水。

1.5组织石蜡切片的制备　各组大鼠分别于脑缺血2h再灌注后24h再次麻醉，经含4％多聚甲醛的PBS(0.01mol/L，pH7.4)灌注液心脏灌注固定后，取脑，以视交叉和其后4mm处两点冠状切片，片厚4mm，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切成5μm厚的连续冠状石蜡切片。

1.6组织形态学检查　将制作好的石蜡切片，行苏木精一伊红(HE)染色，光镜下观察缺血侧大脑皮层的组织形态学变化。

1.7免疫组织化学染色法检测Caspase-3蛋白 石蜡切片经常规脱蜡、水化，滴加第一抗体(兔抗Caspase-3多克隆抗体)后，以免疫组化SP法对切片标本进行染色，DAB染色，蒸馏水洗脱水、透明、封片。显微镜下观察，阳性染色为胞浆或胞核棕色颗粒，阴性对照以PBS或正常山羊血清代替一抗，余步骤同上。Caspase-3蛋白阳性细胞胞浆呈棕黄色。高倍视野下(10×40)记数200个神经元细胞中阳性细胞数。

1.8统计学处理采用SPSS for windows 11.0统计学软件包进行检验，数值以均数±标准差(x±s)表示，采用方差分析或t检验进行数据处理。

2结果

2.1病理学观察　大鼠局灶性脑缺血2h，再灌注24h后缺血侧皮质及海马区结构完整性破坏，神经细胞层次缺如或不清楚，大多数神经细胞胞体缩小，核固缩，胞质嗜酸性深染，细胞周围间隙增大，部分神经细胞结构消失。缺血再灌注组受损神经细胞数与中药小剂量组无显著差异。与缺血再灌注组比较，尼莫地平组、中药大剂量组和假手术组异常神经细胞均明显减少(P＜0.01)，且受损程度较轻，多表现为细胞胞浆轻度深染，核固缩，核仁消失者少见。各组大脑皮质及海马区异常神经元密度。

2.2免疫组化染色观察结果　Caspase-3蛋白表达阳性细胞胞浆呈棕黄色染色。假手术组缺血侧皮质及海马区Caspase-3染色阳性细胞较少。模型组及中药小剂量组缺血侧皮质及海马区Caspase-3表达明显高于假手术组(P＜0.01)，而模型组及中药小剂量组之间比较无统计学意义(P＞0.05)，中药大剂量组和尼莫地平组的缺血侧皮质及海马区Caspase-3蛋白阳性细胞数明显低于模型组及中药小剂量组(P＜0.01)。各组Caspase-3阳性细胞表达数。

3讨论

脑缺血再灌注损伤是指脑缺血恢复血液灌注后，脑细胞损伤反而进行性加重的过程。在此过程中缺血区细胞的死亡方式包括凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)两种。大量实验研究发现，缺血再灌注脑损伤不仅出现神经细胞坏死，同时出现过量的凋亡细胞；在缺血中心区因重度缺血通常发生细胞坏死，在缺血半暗带因轻度缺血则以细胞凋亡为主；在一定时间范围内，缺血再灌注损伤时发生的细胞凋亡比同时间的单纯缺血更严重；脑缺血迟发性神经元死

亡期，则以细胞凋亡为主。

Caspases即胱天蛋白酶家族，受到一定的信号刺激后通过蛋白酶级联反应顺序激活，在细胞凋亡过程中起关键作用。迄今已发现该家族至少存在14个成员，其中Caspase-3作为Caspase级联反应中最关键的效应酶，在凋亡执行过程中起重要作用。已有许多证据表明脑细胞缺血死亡与Caspase-3的活化有关。研究表明，脑缺血后不仅Caspase-3基因的转录增强，而且其蛋白酶活性也有所改变。短暂全脑缺血后海马区神经元凋亡数与Caspase-3活性呈显著正相关。Caspase-3通常以无活性的酶原形式存在，通过细胞表面死亡受体和线粒体两条途径分别由Caspase-8或Caspase-9激活。脑缺血中可观察到Caspase-8 Caspase-9的释放。另外，通过脑室内注射广谱的Caspase及Caspase-3抑制剂获得对缺血性脑损伤的保护作用也支持脑细胞缺血死亡涉及Caspase-3活性的观点。

本实验观察到，丹星通络汤大剂量组及尼莫地平组异常神经元的数目明显减少(P＜0.01)，说明大剂量丹星通络汤及尼莫地平对脑缺血造成的神经元损伤具有保护作用。但二者在效果上没有显著性差异(P＞0.05)。另外丹星通络汤大剂量组能显著降低缺血再灌注后大鼠大脑皮质及海马组织Caspase-3蛋白的表达，与缺血再灌注组比较有显著性差异(P＜0.01)，与尼莫地平组比较无显著性差异。而丹星通络汤小剂量组虽然也能降低脑缺血再灌注大鼠大脑皮质及海马组织Caspase-3蛋白表达，但和缺血再灌注组比较无显著性差异(P＞0.05)，提示小剂量丹星通络汤可能不具备临床疗效。

丹星通络汤以益气活血、温通经脉的原则组方，该方以丹参、胆南星力主，活血通络，清热化痰，有效清除瘀阻于脑络的痰浊和瘀血；另槐花、三七、川芎、红花、大黄活血化瘀，白术、泽泻、黄芩清热燥湿化痰；黄芪、防风、白术益气固表；元参、葛根滋阴清热。近年的药理研究表明，黄芪可抑制脑缺血区促凋亡基因的表达，增强抑凋亡基因的表达；丹参能拮抗脑缺血再灌注引起的SOD活力的下降及MDA含量的升高，并使脑组织NO水平显著下降；红花可抑制脑缺血再灌注后的氧化及脑组织Ca2+超负载；从而均对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。本实验结果显示，丹星通络汤能降低脑缺血再灌注大鼠大脑皮质及海马组织Caspase-3表达，同时同一区域内异常神经元的数目明显减少，提示丹星通络汤可能通过抑制Caspase-3蛋白合成而发挥神经元保护作用，其具体作用机制尚需进一步研究。

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