桂林地区乙肝患者HBVB基因亚型分布研究
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇桂林地区乙肝患者HBVB基因亚型分布研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘要：目的：研究桂林地区乙肝患者HBV B基因亚型分布特点，为本地区乙型肝炎的防治提供依据。方法：采用巢式PCR技术扩增乙肝患者HBV的S基因，经测序后与标准序列比对，采用Mega 5.0构建系统树进行基因亚型分型。结果：从120例乙肝病毒患者中鉴定出3个以前报告的乙肝病毒亚型，序列分型B2 104例，占86.7%；B4 1例，占0.8%；B5 1例，占0.8%，其中14例未分出亚型，占11.7%。结论：桂林地区HBV B基因亚型主要以B2为主，其次为B4、B5，未发现B1、B3、B6亚型。
关键词：乙型肝炎病毒；S基因；B基因亚型；分布
中图分类号：R512.6 文献标志码：A 文章编号：1008—2409（2012）04—0471—03
HBV基因型/亚型的分布具有明显的种族和地域性差异，以往的研究表明我国主要以B和C基因型感染为主，且北方以C基因型为主，南方以B基因型为主，且HBV基因亚型也呈现出一定的地域分布。广西是乙型肝炎高发地区，目前发病状况仍未得到有效控制，且桂林地区HBV基因亚型的分布概况尚无文献报道。HBV基因亚型可能与病毒感染途径、基因突变、疾病进程和抗病毒疗效有一定关系。因此，基因亚型分型对乙肝病毒变异的研究、发病机制的探讨、病情评估、治疗药物的选择和预后判定，以及分子流行病学研究具有重要的意义。目前，HBV全基因序列分析是基因分型的金标准。由于全基因序列分析比较复杂，国内外通常用S区序列来替代全基因序列分析。本研究通过S基因序列分析方式研究桂林地区HBV B基因亚型的分布概况，以期为广西乙型肝炎的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
病毒DNA提取剂DNAout、PCR试剂盒均购于四川天泽基因T程有限公司，Pfu酶购于Takara公司，引物由上海生物工程公司合成，PCR产物测序南北京利嘉泰成生物公司完成。
1.2 研究对象
120份经荧光实时定量PCR鉴定为阳性的HBV感染血清均采自广西壮族自治区桂林市第三人民医院门诊和住院患者，患者来自桂林市区及周边12个县。其中男115例，女58例，年龄5～72岁，患者血清中HBV病毒载量为103～108copy/ml，诊断为慢性乙型肝炎，诊断均符合我国2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》慢性病毒性肝炎的诊断标准。
1.3 HBV—DNA提取和扩增
从患者血清中提取DNA，操作步骤按照说明书进行，以巢式PCR扩增HBV S基因。第二轮上游引物
ATCCGCAGGCCATGCAGTGG
（3191—3211bp），下游引物为GTCGTCCGCGGGATTCAGC（1458—1440 bp），扩增片段长度为1 772 bp，包含了678 bp的S基因，具体操作见文献。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收纯化后，送北京利嘉泰成生物公司进行DNA序列测定，并以DNASTAR分析测序结果。
1.4 HBV基因亚型分型
从GenBank上获得乙肝病毒6种B基因亚型（B1—B6）完整序列，每种基因亚型挑选2条，截取其中的S区作为分型标准序列，与本研究测序所获得的样本以Clustal W比对，Mega5.0分型，最后生成phylogenetic tree。
2 结果
2.1 HBV基因的扩增及测序
120份乙肝患者血清中均扩增出产物，1%的琼脂糖凝胶电泳检测显示，扩增片段为1 800bp左右，与预期相符。部分电泳结果如罔1。将扩增产物送测序，每份PCR产物均进行3个测序反应。将所获得序列与GenBank上HBV的序列进行比对证实确为HBV S基因。
2.2 患者体内HBV的分型
用Mega5.0将120份样本HBV S基因序列与16条标准序列比对后生成系统树，120例B批基因亚型中有B2（86.7%）、B4（0.8%）和B5（0.8%），未知亚型（11.7%），未发现其他亚型。
3
讨论
乙型肝炎病毒（HBV）感染是严重的公共卫生问题，全球约20亿人感染过HBV，慢性HBV感染者达3.5亿；全球每年约100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌。根据HBV全基因组序列差异≥8%或S基因序列差异≥4%，目前将HBV分为9个基因型（A～I），按照全基因组序列差异>4%而
本研究采用S基因序列进行基因亚型分型，Norder等发现S基因序列的变化同全基因序列的变化一致，认为S区能代表全序列的变化而行基因亚型分型。Olingo等胡利用前S/S区测序进行基因亚型分型，证明这种分型方法的可行性。但Pourka—rim等对文献报道的6种基因亚型A1—A6全序列重新构建系统进化树，发现仅有A1，A2和A6能够被称为真正的基因亚型，其他几种亚型都被分到同一支进化树上，应该被称为“准亚型”（quasi—subgeno—types），针对HBV分型方法、标准不一的现状，Ste—phan等建议国际病毒分类委员会制订HBV分型的统一标准，并认为B亚型的分型方法应以测序为主。
本研究发现桂林地区人群HBV感染的B基因亚型以B2为主，其次为B4、B5，未发现B1、B3、R6亚型。