卡那霉素A酶联适配体检测方法研究

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摘 要：通过EDC法偶联辣根过氧化物酶（HRP）和卡那霉素A（Kanamycin，KaA）分子制备酶标记物，采用棋盘滴定法确定链霉亲和素（Streptavidin，SA）的包被浓度为8 mg/L，通过单因素实验优化了检测条件，建立了卡那霉素A酶联适配体检测（Enzyme-linked aptamer assay，ELAA）方法。本方法半抑制浓度（IC50）为2.2 SymbolmA@ g/L，检出限（LOD）为0.04 g/L，检测范围（IC20～IC80）为0.07～71.5 /L，与结构类似物无明显交叉反应；对牛奶、猪肉、猪肝、鸡肉、蜂蜜样品加标回收率在78%～100%之间，平均相对标准偏差小于11.1%。本方法特异性强、灵敏度高，适用于食品中卡那霉素A的快速检测。

关键词：单链DNA（ssDNA）；适配体；卡那霉素A；酶联适配体

1 引 言

卡那霉素（Kanamycin，KaA）是一种氨基糖苷类抗生素药物，水溶性好，抗菌谱广，是我国农业、畜牧业、水产业常用兽药之一。但是，因严重的肾毒性、耳毒性、神经肌肉接头的阻滞作用以及过敏反应[1]，其在畜禽产品中的残留危害日益引起人们关注。欧洲药品评价局（The European Medicines Evaluation Agency， EMEA）规定肉中最大残留限量（MRL）为100 μg/kg，牛奶中为150 μg/kg[2]；日本规定动物组织中MRL为250 mg/kg[3]。

目前，检测的KaA方法主要有免疫测定法[1]、高效液相色谱法（HPLC）[4，5]等。免疫分析法灵敏、特异，简单快速，但抗体制备复杂，研发周期太长[6，7]；仪器方法准确可靠，但样品前处理繁琐，仪器昂贵。所以，研究者一直在寻找新的生物识别分子，以期建立更为简便、灵敏的新方法。

适配体（Aptamer）是近年发展起来的一类单链寡核苷酸，可经体外合成，能高效、特异地结合各种目标分子，具有抗体无法比拟的优势，无免疫原性和毒性，无需动物免疫，已成为近年生物分析的研究热点之一[8，9]。目前，适配体分析方法研究多集中于电化学传感器、荧光法检测[10～12]，且在食品检测中的报道尚不多[13]。本研究通过链霉亲和素-生物素放大策略，采用辣根过氧化物酶（HRP）标记卡那霉素，建立了一种高灵敏、高特异性的单链DNA（Single-stranded DNA， ssDNA）适配体检测KaA的新方法，灵敏度远高于已报道的酶联免疫分析（ELISA）方法[14，15]。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Multiskan MK3酶标仪、Wellwash MK2洗板机（美国Thermo公司）。SA（Promega公司）；HRP、KaA（Sigma Aldrich公司）； Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、柠檬酸、KCl、CaCl2、MgCl2等（分析纯，广州化学试剂有限公司）；生物素标记的KaA适配体（5′-biotin-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3′，上海生工生物工程有限公司合成）。实验用水均为Milipore超纯水。；牛奶、猪肉、猪肝、鸡肉、蜂蜜样品均购置于当地超市。

3 结果与讨论

3.1 链霉亲和素包被浓度优化

适配体通过5′端标记的生物素与微孔板上SA结合，SA包被量对检测信号及灵敏度有很大影响[11]。经优化当SA浓度为8 mg/L、适配体稀释浓度为0.5 nmol/L时，其IC50值为8 μg/L， 分别约为其它组合的1/4倍和1/2倍（图2）。因此，后续实验选择在SA浓度8 mg/L，适配体稀释浓度0.5 nmol/L条件下进行。