自然铜和鹿衔草对裸鼠肺癌骨转移的抑制作用

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇自然铜和鹿衔草对裸鼠肺癌骨转移的抑制作用范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘 要：目的：探讨自然铜和鹿衔草对肺癌骨转移的抑制作用。方法：取15～20g裸鼠，每只裸鼠胫骨骨髓腔内注射0.1mL A549细胞悬液，14天后建立肺癌骨转移模型。随机分为中药组、阳性药物组、模型对照组。中药组按6g•kg-1隔日灌胃自然铜和鹿衔草，阳性药物组按10mg•kg-1每周腹腔注射帕米磷酸二钠，给药3周后处死，称量体重，测量肿瘤体积并计算抑瘤率，流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率、血生化仪检测血钙、磷、碱性磷酸酶及肝肾功能等。结果：与模型对照组比较，中药组和阳性药物组的肿瘤体积缩小，血钙和碱性磷酸酶降低，肿瘤细胞凋亡率升高，尿素氮减少，而阳性药物组体重下降，天冬氨酸氨基转移酶升高；与阳性药物组比较，中药组体重增加，肿瘤体积缩小，抑瘤率提高，血钙、天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶下降，尿素氮升高；3组血清磷和肌酐比较，差异无统计学意义。结论：自然铜和鹿衔草能安全有效地抑制肺癌骨转移导致的骨破坏。

关键词：自然铜；鹿衔草；肺癌；骨转移；抑制

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2012)01-0137-03

Inhibitory Action of Pyrite and Pyrola on Nude Mouse with Bone Metastasis in Lung Cancer

CAO Zhaowen1,YUANG Zhengzhong2,YE Ren2,XU Xiaofeng2，SHAN Zesong2

(1.Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000,Zhejiang,China;

2.The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000,Zhejiang,China)

Abstract:Objective：To discuss the inhibitory action of pyrite and pyrola on bone metastasis in lung cancer.Methods：Take 15～20g nude mice,inject 0.1mL A549 cell suspension into marrow cavity of tibia of every nude mouse,after 14 days,establish the models of bone metastasis in lung cancer.Then they were randomly divided into Chinese medicine group, positive drug group and model control group.The Chinese medicine group were administered the pyrite and pyrola with 6 g kg-1 into stomach every other day.Positive drug group were injected into enterocoelia with pamidronate. Disodium 10 mg kg-1 every week.After three weeks,they were executed and weighed to measure the tumor volume and calculate the tumor-suppressing rate.Use the flow cytometer to detect apoptosis rate, blood biochemistry analyzer to calcium, phosphorus,alkaline phosphatase,hepatic/renal function and so on.Results：Compared to the model control group,in Chinese medicine group and positive drug group,the tumor volume has shrinked,calcium and alkaline phosphatase reduced, apoptosis rate increased and urea nitrogen decreased.And the weight of positive drug group descended, AST increased;by comparison,in Chinese medicine group,the weight elevated,the tumor bulk lessened, apoptosis rate increased,Ca,AST,ALT all fell down and the urea nitrogen has gone up;the differences of serum phosphorus and creatinine among the three groups have no statistical significance. Conclusion：Pyrite and pyrola can safely control bone destruction caused by bone metastasis in lung cancer.

Key words:Pyrite；Pyrola；lung cancer；bone metastasis ；inhibitory action

肺癌晚期常会出现各种部位的转移,其中以骨转移最为常见,骨转移的发生率为20%～40%。如果病变不有效控制，又会进一步加重病情，甚至发生病理性骨折。中医药通过活血化瘀，扶正固本等方法进行治疗[1-3]。鹿衔草被历代医家称为补虚之珍品，能够提高机体的免疫功能达到正胜邪退的目的。自然铜能够促进骨折愈合。临床上常把两药用于治疗肺癌骨转移，对于延缓病情的发展，改善患者的临床症状，提高生活质量等具有较好的疗效。通过此实验研究，探讨自然铜和鹿衔草抑制骨转移瘤的效果及作用机制：

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物BALBC裸鼠，30只，由上海斯莱克动物有限公司提供，许可证SCXK（沪）2007―0005，鼠龄4周，雌雄各半，体重15～20g,在SPF环境中饲养。

1.1.2 材料A549细胞株由温州医学院附属第一医院龙湾医科所惠赠。RPMI-1640培养基干粉、胰蛋白酶和二甲基亚枫购自Gibco 公司。小牛血清购自杭州四季青生物工程公司。Annexin V 凋亡试剂盒购自杭州联科生物科技有限公司。

1.1.3 药物自然铜和鹿衔草的免煎颗粒购自深圳三九现代中药有限公司，1g免煎剂等于10g生药量。自然铜和鹿衔草用0.9%生理盐水稀释，每只裸鼠每次按6g•kg-1给药0.5mL。注射用帕米磷酸二钠购自瑞士诺华制药有限公司, 用0.9%生理盐水稀释，每只裸鼠每次按10mg•kg-1给药0.16mL[4]。

1.1.4 仪器JW2502 电子分析天平:上海天平仪器厂产品。Olympus CKX41 - 32倒置显微镜:日本olympus 光学公司产品。MCO-175 CO2培养箱:日本三洋公司产品。流式细胞仪美国Beckman公司产品，型号：FACScalibur。

1.2 肺癌骨转移动物模型建立[5]

A549单细胞悬液用1640培养基(pH 7.0)加15%小牛血清于37℃5%二氧化碳培养箱中培养，注射前PBS洗净，并调节细胞浓度到1×107个•mL-1。裸鼠戊巴比妥腹腔注射麻醉后用75%酒精消毒股骨及胫骨处皮肤，取19G针头直接于骨性粗隆上刺透骨皮质，然后将针尖插入骨干内注入0.1mL的单细胞悬液。注射完后饲养于动物实验中心SPF环境中，14天后用于实验。

1.3 分组

随机分为3组，每组10只。模型对照组：隔日灌胃生理盐水0.5mL，隔7天腹腔注射生理盐水0.16mL;阳性对照组：隔日灌胃生理盐水0.5mL，隔7天腹腔注射帕米磷酸二钠0.16mL;中药组：隔日灌胃自然铜和鹿衔草0.5mL，隔7天腹腔注射生理盐水0.16mL。

1.4 观察内容

各组裸鼠给药3周后，用摘眼球法采取血液样本，此后断颈处死，剥离肿瘤组织。

1.4.1 肿瘤组织病理特点

肿瘤组织置于脱钙液中3天后，于4%多聚甲醛中固定24h，石蜡包埋，组织切片。HE染色后，观察肿瘤组织镜下特点，并以免疫组化确诊。

1.4.2 体重

实验前测量各组的体重，处死前再次测量体重。

1.4.3 测量肿瘤的长短径 按以下公式计算出抑瘤率[1]：

肿瘤体积(mm3)=π/6×a×b2(a为长径,b为短径)；抑瘤率=(V1-V2)/V1×100%(V1为对照组肿瘤体积，V2为实验组肿瘤体积)。

1.4.4 肿瘤细胞凋亡

肿瘤组织采用EDTA螯合法制备成单细胞悬液后PI(浓度为100mg•L-1)染色，流式细胞仪作细胞凋亡分析。

1.4.5 血清钙、磷、碱性磷酸酶及肝肾功能

摘眼球后，采血0.3mL放入采血管中离心，分离出血清用全自动血生化分析仪器检测。

1.5统计学处理

所有数据采用±s表示，数据采用SPSS 13.0统计软件进行T检验或方差分析。

2结 果

2.1 肿瘤组织病理特点

HE染色后，镜下可见：肿瘤细胞呈腺管状、实性排列，瘤内见坏死；部分肿瘤细胞有黏液变性；肿瘤细胞侵及肌肉、骨组织（图1）。免疫组化结果：TTF-1+、CK+++（强阳性）、Ki67+70%、CgA-、NSE-、CEA-。

2.2体重变化

各组裸鼠在给药前和处死前的体重情况，见表1。

由表1可见，给药前各组体重无显著性差异；处死前，中药组体重降低于模型对照组，但差异无统计学意义，而阳性组体重低于模型组，差异有统计学意义（P

2.3 肿瘤体积及抑瘤率

根据测量肿瘤的长短径计算得出各组裸鼠肿瘤体积和抑瘤率，见表2。

由表2可见，中药组和阳性药物组肿瘤体积小于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），而且中药组肿瘤体积小于阳性药物组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药组抑瘤率高于阳性药物组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 血清钙、磷、碱性磷酸酶

各组裸鼠血清钙、磷和碱性磷酸酶的量，见表3。

由表3可见，中药组血钙低于模型对照组和阳性药物组，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）；阳性药物组血钙低于模型对照组，但差异没有统计学意义。3组血清磷比较，差异无统计学意义。中药组和阳性药物组碱性磷酸酶均低于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），中药组碱性磷酸酶低于阳性药物组，差异无统计学意义。

2.5 肿瘤细胞凋亡率

各组肿瘤细胞凋亡率结果，见表4。

由表4可见，中药组和阳性药物组肿瘤细胞凋亡率高于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），中药组肿瘤细胞凋亡率低于阳性药物组，但是差异无统计学意义。

2.6 肝肾功能

给药后，各组裸鼠肝肾功能的结果，见表5。

由表5可见，中药组天冬氨酸氨基转移酶高于模型对照组，差异无统计学意义，但低于阳性药物组，差异有统计学意义（P＜0.01）；阳性药物组天冬氨酸氨基转移酶高于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。中药组丙氨酸氨基转移酶低于模型对照组，差异无统计学意义，也低于阳性药物组，差异有统计学意义（P＜0.01）；阳性药物组天冬氨酸氨基转移酶高于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。中药组和阳性药物组尿素氮低于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.01）；中药组尿素氮高于阳性药物组，差异有统计学意义（P＜0.01）。中药组和阳性药物组肌酐低于模型对照组，差异无统计学意义。

3讨 论

《灵枢•百病始生》云:“留而不去传舍于胃肠之外,募原之间,留着于脉, 稽留而不去,息而成积。”留者,瘤也。肺癌骨转移中医古代典籍未载其名，一般将其称为“骨瘤”、“骨蚀”、“骨漏疮”、“骨疽”。主要病机是肺肾两虚，瘀血阻络。自然铜：味辛苦，功能散瘀止痛，现代药理表明自然铜能提高骨折组织钙、磷水平，促进骨折愈合[6]。鹿衔草：味甘，归肝肾经，功能补虚益肾、强筋骨，现代药理研究发现鹿衔草能提高机体的免疫能力[7] 。两药合用，“一补一通”，“通补结合”很好的契合了肺癌骨转移的病机。

肺癌骨转移绝大多数表现为溶骨性骨转移。肺癌骨转移主要包括4个步骤：①肺癌细胞的脱落与外侵②肺癌细胞的趋化与迁移③肺癌细胞的黏附④溶骨性骨破坏。正常的骨骼包括两种细胞成骨细胞和破骨细胞，两者之间的平衡和耦联维持着骨代谢的平衡。在溶骨性骨破坏过程中，破骨细胞是主要效应细胞，在巨噬细胞集落刺激因子，细胞核因子KB配基受体激活剂细胞因子及骨基质生长因子的诱导激活下，导致了溶骨性骨破坏的形成。临床上常用血清钙，磷，碱性磷酸酶做为肺癌骨转移血清学指标之一［8］。

中药自然铜联合鹿衔草可以缩小肺癌骨转移裸鼠模型的肿瘤体积，提高抑瘤率，降低血清钙和碱性磷酸酶，提示二者不仅能够抑制肿瘤生长，而且可以缓解溶骨性骨破坏。二药联合可以提高瘤细胞凋亡率，提示二药的疗效机制之一是促进肿瘤细胞凋亡从而抑制肿瘤的生长。此外，通过体重、肝肾功能等比较，表明常规剂量下二药联用比较安全。

肺癌骨转移主要治疗的方法有：外科手术、局部放疗、全身化疗和二磷酸盐类药物治疗等，中医药治疗作为综合治疗的方法可以于这些方法结合，从而提高临床疗效，造福患者。

参考文献

［1］ 张绍阳,余黎,肖璇,等. TNP-470对裸鼠肺癌骨转移瘤生长的影响[J].数理医药学杂志,2006,19(5):489-491.

［2］ 河文峰，吴万垠.肺癌转移与中医五行理论相关性探讨［J］.辽宁中医杂志，2009，36（8）：1348

［3］ 吴建春，李雁.中药抗肺癌转移机制的实验研究进展［J］. 辽宁中医药大学学报，2009，11（4）：71.

[4] KOICHI ENDO,KYOKO KATSUMATA,HARUO IGUCHI.Effect of combination Treatment with a Vitamin D Analog(OCT)and a Bisphosphonate(AHPrBP) in a Nude Mouse Model of Cancer-Associated Hypercalcemia[J].JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH,1998,13(9):1378-1383.

[5] 黄东,黄晓玲，阎雪彬，等. C57BL/6小鼠骨癌痛模型的制备与评价[J].中南大学学报,2008,33(2):115-119.

[6] 高婵,蔡宝昌,李伟东,等.中药自然铜现代研究进展[J].南京中医药大学学报,2009,25(1):75-77.

[7] 田玉先.鹿衔草的研究与应用[J].陕西中医函授,1998,5:1-2.

[8] 韩平.肺癌骨转移机制研究进展[J].重庆医学,2009,38(8):992-994.