植物生长调节剂对药用植物三分三种子萌发的影响

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摘要：以药用植物三分三（Anisodus acutangulus C. Y. Wu et C. Chen ex C. Chen et C. L. Chen）成熟种子为材料，采用L9（34）正交试验研究赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）及浸种时间对三分三种子萌发的影响。结果表明，三分三种子萌发的最佳处理是A2B3C1D2，即赤霉素200 mg/L+ 6-苄基腺嘌呤20 mg/L+吲哚乙酸0 mg/L+浸种时间24 h，该处理的种子发芽率高达97.8%以上，并且种子开始发芽时间、发芽持续时间较短，种子发芽势、发芽指数最高，是比较理想的种子萌发处理方法。对发芽率进行极差分析以及验证试验的结果显示，影响三分三种子发芽率的最佳处理是A3B2C3D1，即赤霉素800 mg/L+ 6-苄基腺嘌呤10 mg/L+吲哚乙酸10 mg/L+浸种时间12 h；4种因素中以浸种时间对三分三种子发芽率的影响最大，其次是6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸，影响最小的是赤霉素，说明浸种时间过长反而对发芽不利。

关键词：三分三（Anisodus acutangulus C. Y. Wu et C. Chen ex C. Chen et C. L. Chen）； 植物生长调节剂；正交试验；种子；发芽

中图分类号：Q949.777.7；S482.8；S11+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）14-3361-03

三分三（Anisodus acutangulus C. Y. Wu et C. Chen ex C. Chen et C. L. Chen）为茄科（Solanaceae）山莨菪属（Anisodus Link et Otto）多年生草本植物，别名大搜山虎、山野烟、野烟、山茄子等，仅分布于云南省西北部，生长于2 700～3 600 m的高海拔地区山坡、草丛或灌木丛中[1]。三分三主要以根、茎、叶及种子入药，有大毒，具有麻醉镇痛、祛风除湿的功效，可治疗骨折、跌打损伤、关节疼痛、胃痛、肠绞痛等病症。三分三的根茎中含有多种托品烷类生物碱，主要是莨菪碱、山莨菪碱、中莨菪碱、东莨菪碱以及微量托品碱[2]，这些生物碱中的莨菪碱、东莨菪碱是反副交感神经作用类药物，临床上主要用作镇静剂使用[3]。三分三是云南省民间的珍稀药用植物，由于野生资源分布范围狭窄、生长环境恶劣，野生资源极其有限。以往民间用药主要靠野外挖掘，但经过长期无序采挖，野生种质资源濒临灭绝。为此有研究者采用植物组织培养技术试图在实验室生产三分三所含的药用成分，如郑光植等[4-7]对三分三的细胞培养生产莨菪碱和东莨菪碱进行了大量的基础研究，潘夕春等[8]用植物组织培养技术诱导三分三的根生产托品烷类生物碱；但这些学者对三分三细胞培养和组织培养生产托品烷类生物碱的探索还处在实验室阶段，离工业化生产还有很长的距离，因此通过人工种植三分三仍然是目前解决三分三药材来源的有效途径。种子萌发是开展药材种植的基础，现在国内还未见对三分三种子发芽的研究报道，本课题组在前期已经对三分三种子的萌发进行过发芽比较试验，发现三分三种子的萌发率不到50%。为了提高三分三种子的萌发率，试验采用植物生长调节剂赤霉素（Gibberellic acid，GA3）、吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）、6-苄基腺嘌呤（6-benzyl aminopurine，6-BA）处理三分三种子，进一步研究了三分三种子的萌发特性，以期为三分三种子育苗、人工种植提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试三分三种子于2011年秋季采集于云南省大理市喜洲镇花甸药材种植基地，采收后晒干、去除杂质，用棉布包裹后置于室内通风处保存。植物生长调节剂赤霉素、吲哚乙酸、6-苄基腺嘌呤均为市售，试剂主要有升汞、乙醇，仪器主要是SPX-250B-D型振荡培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 正交试验设计

试验参照东林等[9]建立的方法，设计了L9（34）正交试验方案，4个因素、3个水平分别是因素A：赤霉素，3个浓度水平分别为40、200、800 mg/L；因素B：6-苄基腺嘌呤，3个浓度水平分别为5、10、20 mg/L；因素C：吲哚乙酸，3个浓度水平分别为0、5、10 mg/L；因素D：浸种时间，3个用时水平分别为12、24、48 h；具体的因素水平组合见表1。比较各组合对三分三种子萌发的影响，并根据正交试验的结果进行验证培养试验。

1.3 发芽方法

发芽试验于2011年11月至2012年6月在大理学院药物研究所完成。三分三种子发芽方法参考文献[10]和[11]的规程。在实验室将三分三种子用0.1%的升汞溶液消毒杀菌8～10 min，再用去离子水冲洗，晾干。种子萌发在直径为16 cm培养皿里完成，培养皿经自来水冲洗、75%乙醇消毒、去离子水洗涤、晾干后，在皿内铺3层干净滤纸作为种子的发芽床，每个培养皿放入经过消毒的三分三种子30粒，每处理（因素水平组合）3次重复。各处理种子都放入振荡培养箱中，在25 ℃恒温、光照环境下培养，培养过程中注意保持滤纸的湿润状态。

1.4 发芽指标

试验以三分三种子的胚根长度≥2 mm作为种子发芽标准，在试验期间每天记录种子萌动数，种子发芽试验结束后统计发芽开始时间、发芽持续时间、平均发芽数，计算种子发芽率、发芽势和发芽指数。

三分三种子发芽率=（发芽期间内能够形成胚根或胚芽的种子数/供试种子数）×100%；

三分三种子发芽势=（到达发芽持续天数一半时的发芽种子数/供试种子数）×100%；

三分三种子发芽指数GI=∑Gt/Dt。

式中，Dt为发芽时间，Gt为相应时间t的正常发芽数。所得试验数据采用正交设计助手Ⅱ软件[10]进行分析。

2 结果与分析

三分三种子室内发芽试验结果显示，在播种2～4 d后三分三种子胚根突破种皮萌发，6～10 d胚突破种皮形成子叶。4因素、3水平L9（34）正交试验对三分三种子萌发的影响结果见表2。分析表2可知，各因素水平组合以A2B3C1D2对三分三种子萌发的影响最大，即赤霉素200 mg/L+ 6-苄基腺嘌呤20 mg/L+吲哚乙酸0 mg/L+浸种时间24 h的处理发芽率为97.8%，是所有处理里最高的；并且种子开始发芽的时间为4 d，发芽的持续时间为5 d，发芽势为90.0%，发芽指数达到了6.8，发芽势和发芽指数是所有处理里最高的，因此是试验范围内较理想的三分三种子萌发处理方法。另外，因素水平组合A2B2C3D1（赤霉素200 mg/L+ 6-苄基腺嘌呤10 mg/L+吲哚乙酸10 mg/L+浸种时间12 h）的发芽率也是97.8%，发芽势也为90.0%，种子开始发芽的时间为3 d，表现也是不错的，只不过发芽指数较低。

为了进一步考察处理之间的差异，对表2中的发芽率进行了极差分析，结果见表3。由极差分析可知，从发芽率的角度考虑，影响三分三种子发芽的最佳处理是A3B2C3D1，即赤霉素800 mg/L+6-苄基腺嘌呤10 mg/L+吲哚乙酸10 mg/L+浸种时间12 h；并且各因素中以浸种时间对三分三种子发芽率的影响最大，其次是6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸，影响最小的是赤霉素，说明浸种时间过长反而对种子发芽不利。用最佳因素水平组合A3B2C3D1处理三分三种子进行萌发验证试验，结果该处理的发芽率高达99.2%，证明A3B2C3D1确实是效果最好的处理，也说明试验结果是可靠的。

3 小结

植物种子萌发技术是开展育苗与种植的基础，东林等[9]用植物生长调节剂赤霉素、吲哚乙酸、6-苄基腺嘌呤处理坚龙胆（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）种子，结果可以显著提高种子的发芽率，本试验结果与之相似。通过L9（34）正交试验，表明赤霉素、吲哚乙酸、6-苄基腺嘌呤、浸种时间4个因素对三分三种子发芽率的影响非常明显，其中浸种时间对三分三种子发芽率的影响最大，其次是6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸，影响最小的是赤霉素；最佳处理是赤霉素800 mg/L+6-苄基腺嘌呤10 mg/L+吲哚乙酸10 mg/L+浸种时间12 h。下一步将对三分三种子发芽后在土壤中的生长情况及成苗率等育苗全程做系统研究。

参考文献：

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[2] XIAO P G， XIAO G C， HE L Y. The occurrence of some important tropane alkaloids in Chinese Solanaceous plants [J]. J Integr Plant Biol，1973，15：187-194.

[3] YAMADA Y， TABAT M. Plant biotechnology of tropane alkaloids[J].Plant Biotechnol，1997，14：1-10.

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[5] 郑光植，梁 峥.药用植物组织培养的研究Ⅱ. 三分三愈伤组织的生长、莨菪碱和东莨菪碱合成的化学调控[J].植物学报，1977，19（3）：209-215.

[6] 郑光植，何静波，王世林.药用植物组织培养的研究Ⅳ. 三分三细胞培养中的激素调控[J].植物学报，1982，24（1）：129-134.

[7] 郑光植，何静波，王世林.药用植物组织培养的研究Ⅴ. 三分三愈伤组织细胞的悬浮培养[J].云南植物研究，1982，4（2）：203-206.

[8] 潘夕春，陈 敏，张 磊，等.植物表达载体在三分三发根中的高效表达[J].中草药，2007，38（4）：588-591.

[9] 东 林，李海峰.植物激素对坚龙胆种子萌发的影响[J].安徽农业科学，2012，40（12）：7100，7206.

[10] 颜启传.种子学[M].北京：中国农业出版社，2001.

[11] 国际种子检验协会.国际种子检验规程[S].颜启传，毕辛华，译.北京：农业出版社，1985.