乳及乳制品中β―内酰胺酶检验方法的探究韩凤霞
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摘要：微生物法作为国标方法检测乳及乳制品中β-内酰胺酶，存在假阳性极高的现象，现有碘量法、酸量法、色谱法、光谱法、试剂盒免疫法，均存在优缺点，故均需要更为科学的论证，目前探究更好的方法针对市场上存在的“无抗奶”的检测尤为重要。
关键词：乳及乳制品 β-内酰胺酶 微生物抑制法 色谱法 碘量法 酸量法 光谱法 试剂盒免疫法
食品安全问题层次不穷的当今社会，抗生素残留问题成为影响乳及乳制品安全的重要因素之一。采用β-内酰胺类药物治疗牛乳腺炎、长期喂饲抗生素的饲料，这两种途径是导致牛奶中常见抗生素的残留[1]。饮用含抗生素的牛奶可能导致饮用者对抗生素的过敏反应，或因长期接触抗生素而导致耐药，因此，世界各国都严格限定原料乳中抗生素最大残留限量[2]。2009年2月我国卫生部等九部门组成的全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治领导小组公布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单（第二批）》中列入乳与乳制品掩蔽抗生素的违法添加的非食用物质。利益的驱使，使得人们人为的使用一些生物制剂（解抗剂）的方法去降解牛乳中的残留抗生素，造成这种人造的“无抗奶”的产生。卫生部确定的原料乳及液态乳中β-内酰胺酶的检测方法为微生物抑制法-杯碟法，该方法经过多个检测机构的验证得出的结果是会导致假阳性率较高。目前，全世界还没有一种比较有效的检测方法、标准能快速、准确及科学、稳定地检测乳及乳制品中β-内酰胺酶。
1、β-内酰胺酶的概念、理化性质、来源及添加在乳及乳制品中对人类的危害
1.1概念
能催化水解6-氨基青霉烷酸（6-APA）和7-氨基头孢烷酸（7-ACA）及其N-酰基衍生物分子中β-内酰胺环及内酰胺键的灭活酶，即能裂解青霉素和头孢菌素类等的有内酰胺环的抗生素，使它们灭活的水解酶，称为β-内酰胺酶，俗称抗生素分解剂或解抗剂，按不同的抗生素大致可分为青霉素酶及头孢菌毒酶、头孢菌素酶三种[3]。
1.2理化性质
纯化的β-内酰胺酶的分子量（MW）为14000～49000[4]，等电位（pl）为4.3～10.5[5][6]，根据分子结构中氨基酸序列差异，将β-内酰胺酶分成A、B、C、D四种类型。
1.3来源
常见的产β-内酰胺酶的菌株有金黄色葡萄球菌、肠球菌、大肠埃希氏菌、肺炎可雷伯杆菌、肠杆菌属、弗氏柠檬酸杆菌、沙雷菌属、普罗威登斯菌属、铜绿假单胞菌。
1.4危害
产生β-内酰胺酶是革兰氏阴性杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药是最重要机制[7]。
该酶的使用可以掩盖牛奶中实际含有的抗生素，导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力。
牛奶中β-内酰胺酶可能来自：一、外源（人为添加到牛奶里），二、内源（牛奶中有关细菌产生）。
2、目前牛奶中β-内酰胺酶的检测方法
2.1微生物抑制法-杯碟法
利用克拉维酸、舒巴坦的特异性抑制β-内酰胺酶的特点做细菌培养，通过测量抑菌圈的大小得出结果。
微生物抑制法-杯碟法优点：不需特殊试剂，容易操作，结果容易判断，对具良好抗菌活性的抗生素灵敏度好，检出限低。
缺点：特异性差，不能用于酶动力学分析，培养时间长，假阳性现象多。需要考虑的因素多（培养基的制备、牛乳抗生素分解剂活性分析、青霉素G浓度的选择、舒巴坦浓度的选择、灭菌条件对酶活力残留的影响，贮藏条件对酶活力残留的影响等等）[8]。
2.2 碘量法
根据青霉素或头孢菌素经β-内酰胺酶作用产生裂解酸与碘结合，可使蓝色的碘淀粉复合物褪色的原理设计的方法，从而判断牛奶中是否掺有抗生素解抗剂，Perret[9]最早建立此法。
碘量法优点：试剂易得、简便易行、再现性好、操作时间短，但假阳性和假阴性现象明显，需作酶阴阳性对照。
缺点：对反映时间要求严格、需要高浓度底物、灵敏度差、检出限高、不能用于酶动力学分析等等缺点，不能广泛应用。
2.3酸量法
根据青霉素或头孢菌素经β-内酰胺酶作用产生裂解酸引起的pH变化，用碱液滴定定量。该法最先由Saz[10]建立用于金黄色葡萄球菌胞外酶的测定，后来发展了许多方法。利用指示剂作终点判定，范围较宽，目前，有用酸度计法快速检测牛奶中残留的β-内酰胺酶[11]，酸度计法由于pH计灵敏度较高，易受到声波、温度、水质和振动等诸多因素的干扰。
酸量法优点：简单易操作、重现性好、灵敏度高、结果稳定性好、假阳性和阴性结果少。
缺点：操作复杂、不适用于头孢菌素的测定、不能用于酶动力学分析。
2.4色谱法-高效液相色谱法
（间接法和直接法）
2.4.1 间接法
利用β-内酰胺酶能够酶解青霉素原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，根据青霉素浓度的变化，利用高效液相色谱紫外检测器分析，判断牛奶中是否添加β-内酰胺酶。
优点：该方法只能定性给出结论；
缺点：无法确切给出定量结果、样品处理相对复杂、费时。
2.4.2 直接法
利用牛奶中青霉素钾在β-内酰胺酶作用下生成青霉噻唑酸钾，并伴随生成少量的青霉胺、青霉醛等物质。牛奶经去脂肪、蛋白质等前处理后，可以将青霉噻唑酸钾提取出来，经高效液相色谱检测确认是否存在该酶。
优点：该方法只能定性给出结论；
缺点：无法确切给出定量结果、生成青霉噻唑酸钾的稳定性需要进一步的科学的数据支持和验证。
2.5 光谱法-紫外分光光度计法
2.5.1 UV法[12]
O’callagham 等首先设计了专用于头孢菌素β-内酰胺酶的简单比色法，即在一定的波长处，头孢菌素Ⅱ在255nm处，青霉素类在232～250nm处，测定经β-内酰胺酶作用前后吸收的变化。
优点：灵敏度高、检测速度快、数据重复性好、可分析0.05～1mmol/L底物浓度，特别适用于该酶抑制剂作用的研究；
缺点：要求酶提取物纯度高、对青霉素类只适用于蛋白核酸成分少、酶活力高的情况。
2.5.2 呈色头孢菌素法[13]
Nitrocefin（87/312）是一种具高反应性的β-内酰胺环的头孢菌素，任何类型β-内酰胺酶在数分钟内可打开其内酰胺环产生由黄变红的清晰色差变化，pH7.0时，在217nm和386nm出有吸收峰，同时出现482nm新的吸收峰，吸收变化可知酶的活力；PADAC与之相似，产生有紫变黄的色差变化，同理可在570nm处测吸光度的变化。
优点：该法正确、灵敏且迅速，对革兰氏阴性细菌检出率较高，尤其对某些细菌如绿脓杆菌酶的检测有独到之处，可用于酶动力学研究；
缺点：某些物质可使结果呈现假阳性，如血清、白蛋白、球蛋白、谷胱甘肽、琉基乙醇等
2.6 试剂盒免疫法
原理：β-内酰胺酶可水解β-内酰胺类抗生素（如青霉素），使其失去抗菌活性，而β-内酰胺酶抑制剂（如舒巴坦）可抑制β-内酰胺酶，使抗生素维持其抗菌活性。
优点：操作简便、结果稳定、检出限精度高、结果直观易懂；
缺点：试剂盒有效期短、价格昂贵、是否需要更多验证。
3、方法讨论
3.1目前国内外还没有一套准确、切实可行的β-内酰胺酶的检测方法。我国市售的乳品大部分都采用巴氏杀菌的消毒办法，该方法使得酶在乳品中的残留活性更高；
3.2多种微生物可以产生β-内酰胺酶，细菌耐药产生的内源性β-内酰胺酶有300多种，同外源性β-内酰胺酶的鉴别技术目前尚没有相关报道，各检测机构研究的检测方法都不能鉴别出是人为添加还是耐药细菌产生的。
3.3乳制品中检出的β-内酰胺酶，其耐药性的机理很复杂，细菌耐药要受到基因的转移、共生菌协同及其基因交叉耐受等因素的影响[14]；
3.4开发新一代高效安全的抗菌剂如抗菌肽来代替抗生素，应用到奶牛细菌性疾病的防治上面来，从源头解决药物残留及解抗剂的滥用问题；
3.5根据现有的国际食源性抗生素耐药微生物的风险管理原则，落实到畜牧业奶业食品安全生产全过程，从乳及乳制品的源头抓起直至安全的食品摆到我们的餐桌上来。
3.6目前探究准确度高、稳定好、灵敏度高、检测速度快、数据重复性好的针对β-内酰胺酶的检测方法，势在必行。
参考文献：
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[6]Bush K.Antimicrob Agents Chemother，1989，33（3） ：271；
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[10]Saz AK et al. J Bacteriol，1961，82：298；
[11]刘姗姗.周正.周巍.张子德.马俊莲.酸度计法快速检测牛奶中残留的β-内酰胺酶[J].食品科学，2010，31（10）：216～218；
[12]Ross GW et al.Anal Biochem，1973，54：9；
[13]Jorgensen JH et al.Antimicrob Agenta Chemother，1982，22（1）：162；
[14]李锦荣.胡科锋.张远平.抗生素分解剂β-内酰胺酶的检测方法研究.现代食品科技，2011，27（8）：1020～1024。