基因指导的华法林用药研究
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[摘要] 目的 回顾性研究基于CYP2C9*3和维生素K环氧化物还原酶亚单位1（VKORC1）1639基因分型结果计算的华法林维持剂量与实际剂量的相关性，并依据该方法进行前瞻性个体化给药研究。 方法 使用华夏时代的快速基因分析方法，检测患者华法林相关的基因类型，并结合患者年龄、身高和体重根据国际华法林药物遗传学协会（IWPC）公式计算华法林的初始给药剂量和理论维持剂量。对63、20例患者标本分别进行了回顾性和前瞻性研究，计算理论维持剂量与患者实际维持剂量，使用SPSS统计分析软件对二者进行相关性研究分析。 结果 回顾性研究结果说明依据基因检测结果的建议维持剂量和实际维持剂量相关性达到42.7%。进一步的前瞻性研究结果中约35%的患者建议维持剂量基本吻合于实际维持剂量。 结论 这种基于快速基因分析的华法林用药剂量的计算具有很高的临床价值，可用于指导华法林个体化治疗。
[关键词] 华法林；VKORC1；CYP2C9*3
[中图分类号] R965 [文献标识码] B [文章编号] 1673-7210（2014）09（a）-0151-05
[Abstract] Objective To study the correlation between the actual Warfarin maintenance doses and the predicted doses calculated based on CYP2C9*3 and VKORC1 1639 genotyping results retrospective， and to study the prospective indiidualized dosing on the basis of the method. Methods Microseq genetic analysis method was used to detect Warfarin-related gene types， Warfarin in patients with related gene types was detected， the predicted initial Warfarin dose and maintenance dose were calculated according to IWPC combined with the patients' age， height and weight. 63 patients and 20 patient samples were carried out for retrospective and prospective study. Their doses were calculated using the formula， the correlation between the suggested doses and actual doses were analyzed using SPSS statistical software. Results Retrospective study results recommended the correlation between the suggested doses and the actual maintenance doses reached 42.7%. Further prospective studies showed that， approximately 35% of patients recommended maintenance dose basically consistent with the actual maintenance dose. Conclusion Such Warfarin dose calculations based on rapid genetic analysis has a high clinical value， and this method can be used to guide individual treatment of Warfarin.
[Key words] Warfarin； VKORC1； CYP2C9*3
华法林是目前广泛应用的香豆素类口服抗凝药，其主要用于预防和治疗血栓栓塞性疾病以及骨关节置换、脑梗死和心脏支架手术术后康复等。因其疗效明确、价格便宜而广泛使用。但是由于华法林的个体治疗范围很窄，剂量受各种因素影响而分布很广，不同个体所需的维持剂量差异可能达到十数倍。如果服用过量则可出现致命性出血，而过低则无法达到抗凝效果，有血栓风险。临床上，医生需根据凝血酶原时间国际标准化比值（INR）多次调整华法林剂量，因而合适的剂量较难达到。影响华法林用药剂量的因素主要分为遗传因素和非遗传因素，在遗传因素中基因维生素K环氧化物还原酶亚单位1（VKORC1）（1639G-A）和CYP2C9*3位点突变与否将对华法林用量产生较大的影响[1]。有研究显示CYP2C9基因的突变型CYP2C9*3，其编码的酶活性比野生型CYP2C9*1降低了80%[2]。而VKORC1启动子上基因位点（-1639G>A）的突变与否也和华法林的剂量密切相关[3]。在亚洲人群中CYP2C9*3和VKORCl（1639G-A）的突变比例则分别达到了4.55%和7.59%左右[4]，因而对于这两个位点的多态性检测更具备临床指导意义。
目前华法林相关基因位点的测序方法主要有sanger双脱氧终止法[5]（常规测序）和焦磷酸测序法等。这些测序方法的报告结果需一至数天，不便于等待服用华法林的患者。而快速的基因检测方法可以缩短出报告的时间。本研究使用微测序基因检测技术，仅检测具有临床意义的基因多态性位点的碱基类型，这样可以在很大程度上减少检测时间，更快地出具检测结果，第一时间提供给临床。使用本方法可以最快在3 h内出结果，更有利于华法林用药的临床个体化治疗的开展。
近来关于华法林药物相关基因的研究很多，但都是停留在回顾性研究基因表型在人群分布、公式推导剂量和病例记录剂量的吻合程度等，真正进行基因型检测后参与指导临床用药的研究报道较少。本实验应用该试剂盒的检测方法进行了部分回顾性研究，并前瞻性参与了指导华法林患者的临床用药，研究基因指导用药过程中存在的问题及临床意义。本研究的结论可以为之后开展基因指导的临床个体化用药提供借鉴和参考。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
1.1.1 试剂 DNA测序系列试剂盒（北京华夏时代基因科技发展有限公司）：预处理液：10 mL/瓶（10×保存液）；耀金保：10 mL/瓶（PHARM-GENE 01 SNP分析保存液）；耀金分：25 μL/支，30支/盒（PHARM-GENE 200 SNP分析样本处理试剂）。灭菌注射用水：5 mL/瓶（国药集团容生制药有限公司）。离心管：1.5 mL。移液吸头：0.5～10 μL、200 μL、1000 μL（Axygen 不带滤芯）。
1.1.2 仪器 移液器：0.25～2.5 μL；20～200 μL；100～1000 μL（Dragonlab TopPette Pipettor）。生物安全柜：BSC-1100 Ⅱ B2-X（BIOBASE 济南鑫贝西生物技术有限公司）；微测序分析仪（Microseq RT-Cycler 436 博奥生物科技有限公司）。台式机电脑：与微测序分析仪连接并安装Microseq分析软件。
1.2 样本选择
1.2.1 回顾性研究 随机选取的63例血液标本来源于北京小汤山医院2012年1月～2013年7月体检中心体检人员，其中男37例，女26例，华法林服用剂量由受试者提供医院。
1.2.2 前瞻性研究 20例患者血液标本，来源于北京小汤山医院2012年1月～2013年6月住院计划服用华法林的患者（房颤16例、心脏支架手术2例、脑梗死1例、髋关节置换1例），所有患者在服药期间均无严重不良反应，均签署知情同意书，研究经医院伦理委员会批准。
1.3 患者血液样本的处理及核酸提取
临床采集患者外周全血2～3 mL于EDTA抗凝管中：①血液样本处理：将待检血液标本颠倒混匀数次；②预处理液（10×保存液）与灭菌水按1∶9比例稀释到工作液（1×预处理液）浓度；③取1.5 mL离心管，加入1 mL预处理液（工作液），取150 μL待检血液标本加入离心管中，上下颠倒充分混匀后，室温静置5 min；④将离心管放入离心机中，配平后3000 r/min离心5 min；⑤离心完成后取出离心管，可以看到在离心管底部有白色小块状物，用枪头吸去上清；⑥加入100 μL PHARM-GENE 01 SNP分析保存液，用移液枪小心彻底混匀，至白色块状物溶解消失，在室温静置30 min。溶液呈现出澄清透明状，-20℃保存备用。
1.4 基因检测
取相应的耀金分基因分析检测试剂，标注好对应的患者编号，待试剂完全熔化后，取编号对应处理好的患者血液样本1.5 μL加入分析试剂液面以下，盖好管盖后，放入仪器并记录对应位置编号，关闭仪器上盖。在电脑端运行Microseq微测序程序，选择标本放置的管口及检测位点后运行检测程序。待检测完成后仪器在结果栏自动给出检测结果的基因类型。
1.5 回顾性研究
1.5.1 回顾性研究中样本的基因检测 使用微测序法对63例样本的CYP2C9*3和VKORC1 1639基因位点进行检测。
1.5.2 回顾性研究中样本的华法林预测维持剂量的计算 依据63例受试者提供的年龄、体重和身高等相关信息，与受试者华法林相关基因的检测结果，带入国际华法林药物遗传学协会（IWPC）公式[7]计算预测维持剂量：IWPC公式：Dose（mg/weekly）=[5.6044-0.2614（age in decades）+0.0087（height in cm）+0.0128 （weight in kg）-0.8677（VK-GA）-1.6974（VK-AA）-0.9357（CYP2C9-AC）-2.3312 （CYP2C9-CC）-0.1092 （Asian race）]2。其中，age in decades：年龄权重：患者年龄的十位数上的数字（56岁取数字5带入计算）；VK-GA：当VKORC1 1639的基因分型为GA（CT）时，VK-GA=1带入公式，否则按照VK-GA=0带入公式；VK-AA、CYP2C9-AC、CYP2C9-CC数值的确定与VK-GA方法一致；Asian race：属于亚洲人群的研究样本取数值1带入公式，非亚洲人群取0。
1.6 前瞻性研究
1.6.1 前瞻性研究中样本的基因检测 使用微测序法对20例前瞻性研究样本的CYP2C9*3和VKORC1 1639基因位点检测。
1.6.2 华法林起始剂量的确定 依据患者的基因分型初步确认起始剂量，再结合患者的体重信息进行调整。起始剂量大小的确定依据Inna等[8]在Blood上刊发的论文。
1.6.3 前瞻性研究中华法林预测维持剂量的计算 与回顾性研究的计算类似，将患者各个数据带入“1.5.2”项下公式计算。
1.6.4 个体化给药指导方法 个体化给药计划：前瞻性研究中的20例患者，首先按建议的起始给药剂量，连续给药5 d后，改为预测的维持剂量给药。同时每天监测患者的INR值，并依据INR值调整剂量。当INR值稳定在2～3之间时，记录实际的维持给药剂量。实际操作中，初始和维持的预测建议剂量由实验者与患者主治医生同时计算，相互核对，再由医生依据患者的实际情况酌情调整后对患者给药。
1.7 统计学方法
采用统计软件SPSS 12.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，行正态分布分析，采用t检验，再进行Pearson相关分析。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 回顾性研究中预测维持剂量与实际维持剂量的相关性
通过对回顾性样本CYP2C9*3和VKORC1 1639位点的基因分型检测，并结合受试者的年龄、身高和体重等相关信息，带入IWPC的公式[7]，计算63例受试者的预测维持剂量。将预测维持剂量与受试者的实际维持剂量进行相关性分析。见图1。
预测和实际维持剂量的相关性分析通过SPSS软件计算，设置检验水准为0.05，两组数据在此条件下均成正态分布，符合检验条件。预测和实际维持剂量的相关性分析采用Pearson相关检验，经过软件计算得到决定系数R2=0.427，说明患者的年龄、身高、体重及基因检测结果等因素可以解释42.7%的给药剂量差异，与以往研究相符。
2.2 前瞻性研究结果
2.2.1 基因分型情况 用微测序法对20例患者样本相关基因进行快速的基因分型，其中CYP2C9*3 AA型基因共有18例，AC型2例；VKORC1 1639 AA型共有10例，GA型共有9例，GG型1例。
2.2.2 前瞻性病例的预测维持剂量和实际维持剂量的确定 根据患者相关基因的检测结果，按“1.6.2”项下方法确定患者的起始给药剂量。由患者相关基因分型结果结合患者的的基本信息带入IWPC公式计算华法林预测维持剂量。按照预测剂量给药后，依据INR值来进行调节，至达到稳态，记录实际维持剂量。将每位患者的预测剂量和实际剂量带入SPSS软件，绘制散点图并计算相关性。见图2。其中20例前瞻性病例研究初始剂量和预测维持剂量计算后，由临床医师结合患者的自身情况和药物情况作出调整便于患者服用。由于医院实际使用药物为2.5 mg/片，患者服药时自己将1片最多分成4份来服用，每份的剂量实际不等，但为方便计算按照平均分配计算，故实际使用剂量中存在多位数小数，1.875 mg表示3/4片，3.125 mg表示5/4片等来计算。预测和实际维持剂量两组数据在P = 0.05均呈现正态分布，符合检测条件，Pearson相关检测结果显示，其相关系数r = 0.710，与以往研究的结果基本相符。
2.2.3 预测剂量和实际剂量相符情况 临床上将连续超出INR值范围作为调整华法令剂量的指标，每次调整的范围在5%～20%，同时实际用药过程患者最小可调整剂量在1/4片。故本实验选择实际维持剂量和建议维持剂量的差异≤20%或者差异绝对值
3 讨论
传统的医学中，不同的患者在同一疾病治疗时采用同一治疗方案，使用相同的药物和同样的剂量，而药物在人体的吸收、分布、代谢则有着巨大的个体差异，这也导致出现了不同的治疗效果、毒副作用和不良反应。影响这些作用的是个人之间的遗传差异和外部环境。随着人类基因组测序的完成和药物基因组学的发展，建立在基因检测基础上的个体化医学已经成为医学发展的新方向。依据基因检测患者外部环境结果医生可以“量体裁衣”式地对患者合理用药，进而提高疗效和减少不良反应的发生。近年来随着华法林药物基因组学的不断发展，在很大程度上解释了华法林的个体差异和种族差异，并且已经将华法林剂量与遗传变异相关性的研究成果成功应用于临床来指导临床实践[9-12]。
本文首先依靠快速的基因检测方法回顾性研究了63例患者样本的华法林相关基因型，并研究了结合患者基本情况推算了维持剂量，通过SPSS软件研究了通过该公式计算的维持剂量和实际剂量的关系，并通过散点图计算其趋势曲线，得到二者的相关性达到了42.7%，该结果与近期国内外研究结果类似[13-15]，说明本检测方法在临床快速基因检测中具有很高的可操作性，并可通过公式计算推测剂量。
前瞻性的研究在对20例患者的CYP2C9*3和VKORC1 1639位点进行快速分型，并结合患者年龄、身高、体重等信息，依据文献[8-9]的公式及方法计算患者的建议初始剂量和预测维持剂量，并对预测剂量与实际剂量进行了相关性分析。结果显示二者相关系数r值甚至达到0.7以上，说明在仅考虑遗传差异、年龄、身高、体重等因素的情况下可以解释约50%的剂量差异。并且经过相符比例的计算，约35%的患者按照建议剂量服药后不需或只需1次调整剂量即可达到稳定维持剂量，可以有效较少患者的痛苦，具有较高的指导用药价值。
但是由于是前瞻性的指导临床用药研究，患者的主治医生对于预测结果的接受程度有限，同时本着患者安全用药为基础的原则，在具体工作中，医生往往以自己的经验为主，辅助参考本研究的基因检测结果和计算的剂量，在初始剂量方面都是按照2～3 mg的剂量来用药，并没有按照已有研究结果建议的剂量给药，这主要是由于相关研究建议的剂量大大超出了医生临床经验的剂量，如果冒然按照建议去使用可能存在风险，然而这也进一步反映了已有研究给出的剂量缺乏临床基础，提示还需要更切合临床的参考计算标准。而在维持剂量的应用上，更多的是给临床医生提示了患者可能的剂量范围，增强了医生给患者增减剂量的信心。本实验由于条件限制，前瞻性研究规模很小，患者多为老年人，且突变概率较高，尚需进一步大样本研究，以进一步优化本研究所述的基因检测指导用药方法，同时进一步验证其临床意义。
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（收稿日期：2014-05-04 本文编辑：卫 轲）