注射用乙酰谷酰胺细菌内毒素检查方法的研究

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[摘要] 目的 建立注射用乙酰谷酰胺细菌内毒素检查方法。方法 参照中国药典2010年版二部附录XI E细菌内毒素检查法进行试验。结果 供试品在0.5mg/ml稀释浓度下无干扰作用。结论 注射用乙酰谷酰胺的检查可用细菌内毒素法代替家兔法。

关键词：注射用乙酰谷酰胺细菌内毒素检查干扰试验

中图分类号：R827.22 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2011）05-0192-03

1实验材料与仪器

1.1注射用乙酰谷酰胺：

批号100113、100114、100118（热原检查合格样品）规格：0.3g

1.2细菌内毒素工作标准品：

批号150601-200965规格180Eu/ml（中国药品生物制品检定所）

1.3鲎试剂：

灵敏度0.25EU/ml，规格0.1ml/支，批号0908060（湛江博康海洋生物有限公司）批号0907012（湛江安度斯生物制品有限公司）细菌内毒素检查用水：规格5ml/支，批号0906010（湛江安度斯生物制品有限公司）

1.4仪器

超净工作台，漩涡混合器，电热恒温水浴锅，经250℃1h处理的玻璃仪器及内毒素检验专用器具。

2方法与结果

2.1鲎试剂灵敏度复核

按《中国药典》2010年版二部“鲎试剂灵敏度复核试验”进行试验，结果符合规定。见表1。

2.2细菌内毒素限值(L)的确定

按公式L=K/M确定，K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K为5EU/(kg•h)；M为人用每公斤体重每小时最大剂量。根据注射用乙酰谷酰胺的用法用量，每次注射的最大剂量： 0.1～0.6g/60kg，则M=600/60(mg/kg)。L=［5EU/(kg•h)］/［10mg/(kg•h)］=0.5EU/mg。

2.3干扰试验有效浓度的计算

目前用于药品检验的鲎试剂灵敏度一般在0.5EU/ml（λmax）～0.03 EU/ml（λmin）之间，故本品按0.5 EU/mg的限值进行细菌内毒素检查时的最高有效浓度（Cmax）最低有效浓度（Cmin）应为：Cmax＝λmax/L＝（0.5EU/ml）/（0.5EU/mg）＝1mg/ml；Cmin＝λmin/L＝（0.03 EU/ml）/（0.5 EU/mg）＝0.06mg/ml。

2.4干扰试验预试验

取样品1瓶，加入细菌内毒素检查用水溶解为30mg/ml的溶液，再作15、30、60、120、240倍稀释，同时每一稀释度下均制备含有2λ浓度细菌内毒素工作标准品的样品溶液。结果见表2。

预试结果表明，注射用乙酰谷酰胺细菌内毒素检查方法有抑制作用，但稀释至1.0mg/ml以上则可能排除抑制作用，为增加实验结果的有效性，采用0.5mg/ml样品溶液进行干扰试验。

2.5干扰试验

按《中国药典》2010年版二部的干扰试验方法进行试验。从预试结果可知，注射用乙酰谷酰胺在0.5mg/ml时有可能排除干扰，以细菌内毒素检查用水及浓度为1.0mg/ml的样品稀释液分别将细菌内毒素工作标准品配成浓度0.5、0.25、0.125、0.0625EU/ml的溶液(分别称S和T系列)，采用两个厂家的鲎试剂测定并比较同一批细菌内毒素工作标准品在两个溶液中的效价(Es及Et)，同时分别以细菌内毒素检查用水和样品0.5mg/ml溶液作阴性对照。结果按公式：Es=lg-1(ΣXs/4)和Et=lg-1(ΣXt/4)计算，其中Xs和Xt分别为S和T系列各反应终点细菌内毒素浓度的对数值。结果见表3。

结果表明，Es在0.5λ～2.0λ范围内，且Et均在0.5Es～2.0Es范围内。确证注射用乙酰谷酰胺的非干扰浓度为0.5mg/ml时，在进行此品种的细菌内毒素检查时最大可选用的鲎试剂灵敏度为λ＝C×L＝0.5×0.5＝0.25EU/ml。

2.6细菌内毒素检查方法验证

3批样品依据《中国药典》2010年版二部附录XI E进行检查。结果见表4。

另分别将3批注射用乙酰谷酰胺150mg/ml的溶液溶解、稀释细菌内毒素工作标准品（即污染样品），使其污染细菌内毒素达到限值18EU/ml，再将污染细菌内毒素的注射用乙酰谷酰胺溶液稀释为0.5mg/ml，同上检查，结果见表5。

从上表结果可见，加入细菌内毒素的3批样品细菌内毒素检查均呈阳性，说明稀释排除干扰的处理不会影响注射用乙酰谷酰胺中细菌内毒素的检出，用细菌内毒素法代替家兔法完全可行。

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