枣木葡聚糖转移酶基因的表达分析
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摘 要：为研究木葡聚糖内糖基转移酶（XTH）与枣果实生长及成熟软化的关系，采用普通PCR及3’ RACE扩增技术，从鲜枣品种梨枣和沾化冬枣中均克隆到XTH基因的部分序列；同时，利用实时荧光定量PCR技术，研究了2个鲜枣品种的不同生长期其采后常温贮藏过程中XTH基因的相对表达量的变化。结果表明，从梨枣和沾化冬枣中克隆的XTH基因片段均为776 bp，包含636 bp的开放阅读框，编码212个氨基酸，分别命名为ZjXTH1和ZjXTH2（登录号分别为：HQ896312和HQ896313）。通过Blastn和Blastp对序列同源性进行比对分析，ZjXTH基因与已登录的其他物种的XTH基因相似性在68%～78%。实时定量PCR表达分析表明，ZjXTH基因的表达从盛花后51 d开始积累，并且在枣果实成熟软化过程中的表达量显著高于果实的生长期。梨枣ZjXTH1基因在采后贮藏中呈现“上升-下降-上升”的变化规律，在果实转为全红以及后期迅速软化时表达量均较高。沾化冬枣ZjXTH2基因在采后贮藏中呈现先上升后下降的趋势，在果实转为全红时表达量最高。研究结果说明，XTH基因在枣果实的成熟软化中可能起着一定的促进作用。
关键词： 枣果实； XTH基因； 实时荧光定量PCR
中图分类号：S665．1 文献标识码：A 文章编号：1009－9980?穴2011?雪06－998－07
Cloning and expression analysis of xyloglucan endotransglucosy- lase/hydrolase (XTH) gene in jujube fruit
LV Yan-rong，REN Xiao-lin*
（College of Horticulture, Northwest A& F University， Yangling， Shaanxi 712100 China）
Abstract: In order to study the relationship of Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) and fruit growth and softening in two jujube （Ziziphus jujuba M.） cultivars， Li jujube and Zhanhua Dong jujube， two partial XTH cDNA sequences were obtained by 3 RACE， and the expression of XTH genes during fruit growth and ripening at the room temperature was investigated by real-time quantitative PCR （RT-qPCR）approach. The results showed that， the two partial XTH cDNA sequences named ZJXTH1 (GenBank accession number: HQ896312) and ZJXTH2 (GenBank accession number: HQ896313) were 776bp， containing 636 bp ORF and coding 212 amino acids. The results of homologous analysis in GenBank demonstrated that the ZJXTH sequences were 68% to 78% identical with those of other plants on the nucleotide sequences and the deduced amino acid sequences. The expression of ZJXTH genes accumulated since 51 days after flowering in both jujube cultivars and was markedly higher during the fruit ripen and storage than the growth period. The ZJXTH1 expression displayed up-down-up trend during the storage， and the maximums appeared in the fruit turning red and rapidly softening period. The ZJXTH2 expression displayed up-down trend during the storage， and the maximum appeared in the fruit turning red period. All these results suggest that the XTH gene might play a promoting role in the jujube fruit ripeness and softening process.
Key words: Jujube fruit； XTH gene； Real-time PCR
果实的成熟衰老与细胞壁结构的变化密切相关，而开花植物的细胞壁主要由纤维素、半纤维素、果胶和一些结构蛋白组成[1]。木葡聚糖是双子叶植物初生壁中含量最丰富的半纤维素，这种长链的多糖能够与纤维素微纤丝形成氢键，可以对相邻的微纤丝分子进行约束和支撑[2]。改变木葡聚糖的交叉连接结构，可能直接或间接的对纤维素-木葡聚糖交联网络的松弛产生一定影响[3]，从而引起细胞壁结构的变化。20世纪70年代，Albersheim等[4]提出一种假说，在细胞伸长和膨胀时，存在一种糖基转移酶，它可以使木葡聚糖的一部分与自身连接。Nishitani等[5]在研究豌豆（Pisum sativum）茎的伸长时发现并分离出这种酶。2001年第9 届国际细胞壁研讨会上，将这种糖基转移酶定名为木葡聚糖内糖基转移酶/ 水解酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase， XTH）[6]。木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶（XTH）属于糖苷水解酶家族16的成员，它具有转糖基酶（XET）和水解酶（XEH）的双重作用，可以通过调控木葡聚糖代谢引起细胞壁的松弛[7-8]，从而促进果实的衰老软化。已有研究也表明，XTH与细胞的伸长[9-10]、细胞壁的延展性[11]有密切关系。目前，已经在猕猴桃[12]、苹果[13]、砂梨[14]、番茄[15]、荔枝[16]、草莓[17]、龙眼[18]等果实中克隆到XTH基因，这些研究还表明，XTH在果实的成熟及软化过程中起到一定的作用。
枣（Ziziphus jujuba Mill.）是中国重要的特色果树，以其果肉脆甜、营养价值高而深受消费者的喜爱，但是贮存和运输过程中，鲜枣容易发生酒软、霉变等，这一直是实际生产中的一大难题。梨枣和沾化冬枣是生产中较普遍的栽培品种，梨枣果实较大，但果肉质地不如沾化冬枣细嫩，且采后沾化冬枣的果肉软化的进程较慢，耐储性更好。我们梨枣和沾化冬枣果实为试材，克隆到XTH基因的部分序列并对果实生长及成熟衰老过程中该基因的表达规律进行分析，从而为研究XTH基因在枣果实软化过程中的作用及分子调控机理提供一定的理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
试验材料梨枣和沾化冬枣均取自陕西高陵一个管理良好的、有12 a树龄的枣园，选取长势良好的枣树为试材，单株为1个重复，重复3次，分别在盛花期后的第30、37、51、65、79天采集生长期果实。2010年9月18日（盛花期后第95天）采集成熟果实，采后当天运回实验室，挑选大小基本一致、无病虫害、无机械损伤的果实为试材，用0.03 mm的PVC薄膜袋分装，每袋0.5 kg，室温（20±1）℃贮藏，定期随机取样。各时期样品重复3次，每个重复取10个果实。各时期果实样品均先切成小块，液氮速冻后置于-70 ℃冰箱中保存备用。
1.2 枣果实总RNA的提取及cDNA的合成
参照宋蓓等[19]的改良CTAB-LiCl方法提取幼果期（盛花后37 d）果实的总RNA。cDNA第1链的合成按照宝生物公司的TaKaRa反转录试剂盒说明书进行，反应条件为：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，然后置于冰上急速冷却，-20 ℃保存。
1.3 XTH基因的克隆、测序及生物信息学分析
参照砂梨果实[14]上的XTH简并引物X1和X2[上游引物X1： 5’-GGNDATTCTGCTGG（A/C/G）AC （C/T）GT-3’；下游引物X2：5’-GT（A/G/T）GCCCA（A/G）TCNTCNGC（A/G）TTC-3’]进行PCR扩增，反应条件为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 40 s，47.3 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环；最后72 ℃ 延伸10 min获得基因部分片段。根据测序结果和宝生物公司的TaKaRa 3’ Full RACE Core Set Ver. 2. 0试剂盒异引物设计要求，设计XTHl的特异引物GSP1和GSP2（GSP1:5’ -TGTCACTGCCTATTAT TT ACGCTC-3’; GSP2: 5’ -CACAAGGGAAAGGAGACAGAGAGC-3’），均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。3’ RACE扩增参照宝生物公司的TaKaRa 3’ Full RACE Core Set Ver. 2. 0试剂盒说明书进行操作，采用50 μL的反应体系。首先用GSP1和试剂盒中的Outer引物进行第1轮PCR扩增，反应条件为：94 ℃ 预变性3 min；94 ℃变性40 s，57.5 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。取7 μL的反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳，对目的条带则进行回收。
目的基因片段的回收均采用天根公司的胶回收试剂盒，取5 μL DNA回收产物，连入pMD-19T载体，转化Top10大肠杆菌菌株，蓝白斑筛选后，挑白色单菌落进行菌落PCR检测，对含有目的基因的单菌落用液体LB（+Amp）进行37 ℃摇菌，然后对菌液进行测序。
将测序得到的3’ RACE结果与简并引物得到的序列拼接，然后在NCBI中利用Blastn对核苷酸序列进行比对分析，用Blastp及ExPASy在线分析软件对推导的氨基酸序列进行分析。
1.4 基因实时荧光定量PCR分析
参照宋蓓等[19]的改良CTAB-LiCl方法提取各时期果实的总RNA。cDNA第1链的合成按照宝生物公司的TaKaRa反转录试剂盒说明书进行。总RNA的纯化首先用DnaseⅠ和RNase inhibitor参照宋蓓等[19]总RNA的纯化方法进行，采用50 μL酶解体系：20 μL总RNA、2 μL 5 U・μL-1的DNaseⅠ、5 μL 10×DNaseⅠBuffer、0.5 μL 40 U・μL-1的RNase Inhibitor，加入22.5 μL DEPC 水补足50 μL。纯化后的总RNA根据测定OD值确定RNA的浓度和纯度。第一步反转录时按照10 μL体系中包含500 ng的总RNA量进行。对反转录的cDNA测定OD值，再次确定cDNA的浓度和纯度，然后用灭菌的双蒸水对cDNA进行稀释，达到约300 mg・L-1的终浓度。
以枣histone3（His3）基因为内参（登录号为：EU916201），设计特异引物H1和H2（H1: 5’ -CCA GCTTGCTCGTAGAATTAGG-3’； H2: 5’-AACAGATAAACACGCAGATTGA-3’）。根据枣果实XTH基因测序结果，分别设计梨枣和冬枣实时定量特异引物P1和P2（P1: 5’ -TGTCACTGCCTATTATTTACGCT-3’； P2: 5’ -TTGTTGCTCTCTGTCTCCTTTCC-3’）、P3和P4（P3: 5’-GGAAAGGAGACAGAGAGC AACAA-3’；P4: 5’-GGAGTCCCATCAACATAGAAAAC-3’），对各对引物均进行PCR扩增（反应条件中退火温度分别为55.5、56.5、56 ℃，其他条件X1和X2的PCR扩增程序），目的片段回收、测序，以确定目的片段序列正确。
实时荧光定量PCR用iCycler iQ5 实时定量PCR 仪器（Bio-Rad，美国）进行。反应体系为20 μL，其中包含：10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM II（TaKaRa），1.0 μL 稀释后的cDNA，7.4 μL ddH2O，上下游引物各0.8 μL（引物浓度10 mol・L-1）。运行程序为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35次循环。每个样品3次重复。
根据 Livak等[20]的2-CT 公式计算基因相对表达量，其中CT =（CT目标基因-CT内参基因）Time x-（CT目标基因-CT内参基因）Time 0。CT目标基因和CT内参基因分别是目标基因和内参基因的CT值；Time x指留样不同时间点，Time 0指采收当天，以采收当天的样品作为参照，将其目标基因的表达量值转化为1，其他各时期的目标基因的表达量与其比较，从而获得目标基因在各采样时期的相对表达量的差异。
2 结果与分析
2.1 XTH基因片段的获得
本试验采用改良CTAB方法提取枣果实的总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳分析表明，28S与18S条带清晰，无拖尾，且D260 nm/D280 nm为2.10左右，说明提取的总RNA结构完整且纯度较高，符合反转录的要求。通过简并引物对梨枣和沾化冬枣的反转录cDNA进行PCR扩增，均得到了约350 bp的条带（图1）。将2个品种目的片段的测序结果通过Blastn比对，结果表明2者与苹果XTH8基因（序列号：EU494967）的核苷酸序列相似性均为77%，与番茄XTH3基因（序列号：AY497476）相似性分别为77%和76%，从而认为所获得的片段为枣果实XTH基因的一部分。
2.2 XTH基因3’端的获得
运用设计的3’ RACE Outer引物以及TaKaRa试剂盒中包含的Outer引物，分别对梨枣和沾化冬枣进行PCR扩增，均得到了长约800 bp的目的条带（图2），将目的条带连入pMD-19T载体进行测序，结果表明，2条目的片段均为759 bp，且都包含明显的Poly（A）结构，从而表明，克隆到了XTH基因的3’末端。
将获得的3’RACE所得序列与保守序列拼接后，删除重叠区域，从而得到梨枣和沾化冬枣的XTH3’端均为776 bp的核苷酸序列，分别命名为ZJXTH1（登录号：HQ896312）和ZJXTH2（登录号：HQ896313）。这2个序列均包含636 bp的开放阅读框和140 bp的3’端非编码区，编码212个氨基酸。
2.3 枣果实3’端XTH基因核苷酸序列与推导的氨基酸序列同源性分析
通过DNAMAN对获得的ZJXTH1和ZJXTH2的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比对，结果表明2者的相似度均为99%。运用GenBank中的Blastn对ZJXTH1和ZJXTH2的核苷酸序列与已有的其他物种进行相似性分析，结果表明，2者与杂种月季RhXTH2（AB428379）的相似性分别为76%和75%，与苹果XTH8（EU494967）和番茄XTH3（AY497476）的相似性均为75%，与长叶猕猴桃XTH9（EU494954）的相似性均为74%。通过Blastp对ZJXTH1和ZJXTH2推导的氨基酸序列分析，ZJXTH1与苹果MdXTH2（AAN07898）、甜瓜XTH2（ABI94062）、长叶猕猴桃XTH9（ACD03219）、野芭蕉XET（ABL10090）和荔枝XET3（ABK30789）的相似度分别为 78%、75%、76%、71%和69%（图3），ZJXTH2与上述5个物种的相似度分别为76%、74%、75%、71%和68%。
通过ExPASy在线分析表明，ZJXTH1和ZJXTH2推导的氨基酸序列属于糖苷水解酶家族16的成员，均含有保守的序列模块（GH16-XET）：E-[L I V]-D-[L I V F]-x（0，1）-E-x（2）-[G Q]-[K R N F]-x-[P S T A]（图3），其中的2个谷氨酸（E）是活性位点。另外，通过Blastp分析还表明，得到的2个基因C端均含有XET-C模块（图3），由C端的将近60个碱基翻译的氨基酸组成。
2.4 枣果实生长及采后常温贮藏过程中硬度的变化
由图4-A可知，在果实生长过程中，梨枣硬度呈先升高后下降的趋势，在盛花后37 d硬度达到最大，随着果实的生长，硬度逐渐下降；沾化冬枣硬度在盛花后30 d硬度最大，之后的7 d有明显下降，随着果实的生长，硬度基本稳定。
由图4-B可知，果实采收后，梨枣和沾化冬枣硬度总体均呈下降的趋势，但后期梨枣硬度下降更迅速。前期贮藏过程中，梨枣硬度呈平缓的下降趋势，第7天时果实已经变为全红，但此时硬度还没有显著变化。第10天时硬度显著下降，且果实开始呈现酒软的状态，到采后第12天果实完全酒软，硬度降至最低。沾化冬枣贮藏初期（至第6天）硬度略显下降，随后的2周硬度基本保持，第20天时果实基本达到全红，果实硬度开始呈现下降趋势，直到采后28 d多数果实呈现酒软，硬度降至最低。
2.5 枣果实生长及采后常温贮藏过程中XTH基因相对表达量的变化
由图5可知，在梨枣果实生长过程中，XTH基因的表达从盛花后51 d开始积累，呈缓慢上升的趋势，盛花后第79天达到高峰，且与采收当天的表达量接近。采后常温贮藏过程中，XTH基因的表达呈波动性“上升-下降-上升”的变化趋势，贮藏第6天表达量达到前期峰值，是采收当天的11.3倍，之后表达量逐渐下降，在采后第10天时降至最低；随着果实的逐步衰老，XTH基因的表达又呈现上升趋势，到采后第12天时达到后期的表达高峰，是采收当天的9.3倍。
从图6可以看出，在沾化冬枣生长过程中，XTH基因的表达也从盛花后51 d开始积累，但整个生长期表达量均较低。随着果实的成熟，该基因的表达才逐渐增加。采后常温贮藏中，XTH基因的表达整体呈现先升高后降低的趋势。采后0～9天，XTH基因的表达缓慢上升，在采后15 d时，表达量显著增加达到采收当天的5.3倍，在后期的贮藏过程中，表达量逐渐降低，直到采后27 d降为采收当天的1.7倍。
3 讨 论
XTH属于多基因家族，目前已有较多研究者对XTH基因不同家族成员在果实成熟软化中的作用进行探索。本试验从枣的2个鲜食品种中均克隆到了XTH基因的部分序列，2者编码的氨基酸序列相似度达99%，与其他物种的相似度也达到了60%～78%，且2个XTH基因成员编码的氨基酸序列的差异均未发生在保守区，它们都包含糖苷水解酶家族16的保守序列；同时，该保守序列也是木葡聚糖转移酶（XET）的保守序列，具有转糖基的作用，从而可以裂解细胞壁中的木葡聚糖多聚体[7]，因而可能对果实的软化起一定的作用。
Goulao等[13]对苹果的2个XTH基因（MdXTH1和MdXTH2）研究表明，2个XTH基因在成熟果实中均有表达，但表达模式有所差异。MdXTH1在叶片、花朵及果实中持续表达，但是在果实成熟时表达量较高；MdXTH2在膨大期果实中开始积累，果实成熟时达到最大值，随着果实的衰老表达量逐渐降低，在其他组织中表达量很低。Atkinson等[21]对猕猴桃14个XTH基因成员的表达特性研究表明，Ad-XTH4、Ad-XTH5和Ad-XTH7在果实成熟软化过程中的表达量较高，并且在果实成熟过程中Ad-XTH5和Ad-XTH7均呈现先上升后下降的趋势；另外Ah-XTH9在果实成熟过程中表达量较低，同时也呈现先上升后下降的趋势。本试验中枣果实的XTH基因序列与苹果MdXTH2和猕猴桃Ah-XTH9相似度较高，但是与2者的表达规律有所不同。枣果实ZjXTH基因的表达从盛花后51 d开始积累，并且在果实成熟软化过程中的表达量显著高于果实的生长期，这与猕猴桃Ad-XTH4、Ad-XHT5和Ad-XTH7的表达模式相似。梨枣ZjXTH1基因的表达在采后贮藏初期呈现先上升后下降的趋势，其中在果实达到全红时（采后6 d）时表达量最高，这与Ah-XTH9的表达规律有一定的相似性；贮藏后期，在果实迅速软化阶段ZjXTH1的表达量又呈现上升趋势，这表明ZjXTH1基因可能对梨枣的软化起到一定的促进作用。沾化冬枣ZjXTH2基因的表达变化规律与猕猴桃Ad-XHT5和Ad-XTH7相似，在采后果实的成熟软化过程中呈现先上升后下降的趋势。在采后第16天，ZjXTH2表达量最高，此时果实已有半数达到全红，但果实硬度并没有显著的变化。从采后22 d开始，果实软化迅速，ZjXTH2表达量也略有上升。这些结果表明，在冬枣软化前期果实转红阶段以及果实后期的迅速软化阶段，ZjXTH2基因均发挥作用。由上述结果推测，XTH基因在枣果实的成熟中对前期果实颜色的转变和后期果实的迅速软化均可能起着一定的促进作用，而在果实的生长过程中的调控作用不明显。
通过上述分析，推测XTH基因在枣果实的成熟软化中可能起着一定的促进作用，而在果实的生长过程中的调控作用不明显。在梨枣和沾化冬枣中，克隆到得2个XTH基因整体的表达量变化趋势相似，但是在果实软化的后期也略有差异，这也表明，对于不同的物种抑或是同一物种的不同品种，XTH基因的不同成员的表达模式及调控作用也可能会有差异。由于XTH属于多基因家族，推测在枣果实中也应该还存在多个其他的XTH基因的家族成员，因而要全面了解XTH在枣果实生长及成熟软化中的调控机制，还需其他的XTH家族成员的表达特性进行深入研究。
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