胰激肽原酶的制备方法和质量控制

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摘要：介绍了胰激肽原酶的制备方法和质量控制，并对其研究与开发的思路进行了讨论。

关键词：胰激肽原酶；制备方法；质量控制

中图分类号：Q556+.3文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)08-0025-04

激肽原酶（kininogenase，EC 3.4.21.8）是一组具有特异性、局限性蛋白质水解作用的丝氨酸蛋白酶，又称激肽释放酶（kallikrein）。它能使底物激肽原（kininogen） 释放出一类多肽即激肽（kinin），而激肽对体内的血管和平滑肌有明显的作用。

激肽是在结构上相似的一类多肽激素，主要由不同专一性激肽原酶作用于激肽原而产生。以九肽的舒缓激肽（bradykinin）生物活性最强，是由血液中激肽原酶的作用产生的；其次是十肽的胰激肽（kallidin），是由胰腺等组织中的激肽原酶作用于胰激肽原（kallidingogen）产生的。因此，由胰腺制得的激肽原酶称为胰激肽原酶（kallidinogenase）。我国药品标准将英文名定为 pancreatic kininogenase更为一目了然[1，2]。

现对胰激肽原酶的制备方法和质量作一介绍，并对其研究与开发思路进行讨论。

1制备方法

1.1传统工艺

先将0 ℃以下的丙酮加入猪胰脏中，于0 ℃左右脱水，制得干燥粉。用稀醋酸提取干燥粉，提取液加冷丙酮沉淀，乙醚脱脂，得沉淀物。此沉淀物用稀氯化钠溶液溶解，在pH 8过滤，滤液加冷丙酮使浓度达40 %，离心后清液中补加冷丙酮至浓度为60%，离心，洗涤沉淀并干燥即为酶的粗品。

将粗品溶于pH 4.5的稀醋酸盐缓冲液，离心，清液加入弱酸性阳离子树脂吸附，用pH 4.5的氯化钠溶液洗脱，洗脱液透析脱盐，冻干，即得精品[3]。

此工艺可用丙酮脱水及时处理胰脏，保持酶活性，便于贮存，合并批量投料。然后利用pH 8和pH 4.5介质去除部分杂质，再用丙酮分级沉淀得粗品。

胰激肽原酶的等电点为3.9~4.1，在pH 4.5以下不稳定，故在pH 4.5条件下以弱酸性树脂吸附。这里树脂与酶之间的结合部分是离子的，部分是疏水结合[1]。

李立恒等[4]改进了传统工艺。采用加入对酶有激活作用的Ca2+盐酸溶液取代醋酸提取干燥粉，由搅拌树脂吸附，改为柱色谱，明显提高了产品收率和比活。

1.2DEAE-纤维素吸附工艺

丙酮制成干燥粉，用稀醋酸钠（pH 6，内含CaCl2）提取，离心，上清液55 ℃处理5 min，离心去沉淀，用氢氧化钠调pH至7，加丙酮沉淀、抽滤，滤液加水稀释。

在稀释液中加DEAE-纤维素（pH 7磷酸盐缓冲液平衡）吸附，氯化铵溶液洗脱，洗脱液用冷丙酮70%浓度沉淀，干燥得粗品。

粗品溶解后调pH至5，上DEAE-纤维素色谱柱（pH 5醋酸钠缓冲液平衡）,用浓度较大的醋酸钠缓冲液洗脱，收集酶活性部分，减压浓缩，对蒸馏水透析。

透析液调pH至6.7，上DEAE-Sepharose CL-6B柱（pH 6.7醋酸钠缓冲液平衡），用浓度较大的醋酸钠缓冲液洗脱，得2个活性峰，减压浓缩，蒸馏水透析，真空干燥得产品[5]。

此工艺是使介质的pH大于酶的等电点，用阴离子交换树脂利用不同pH进行纯化。从生产的角度，笔者认为可省去DEAE-Sepharose CL-6B色谱步骤，因为该酶产品不需将两种活性成分分离。

对上述两种工艺加以分析，可以看出：（1）利用不同pH介质，用离子交换剂进行纯化是适当的。随着近年不断推出新的离子交换剂，宜选用更适当的吸附剂；（2）早年用透析去掉小分子杂质效率较低，可改用大型超滤设备，既可去掉小分子杂质，又可达到浓缩的目的；（3）在以胰脏为原料的生产过程中，Ca2+既有激活酶的作用，又有稳定酶的效果，是常规的步骤之一；（4）实验室操作用柱色谱比静态吸附效果好，而生产中因当然静态吸附有时效率较高，用什么方式应视具体生产情况而定。

张建新等[6]报道，用离子交换色谱法制备高纯度酶，其特点是上样量较大，在纯化过程中流速较快，纯化中间体只需一步即可达到质量标准的要求，但该文未报道所用交换剂的型号。

汪晓英等[7]报道的制备方法基本流程与周祖荫等[5]的类似，部分条件有些差异，也是以DEAE-纤维素为交换剂。

1.3盐析与疏水色谱相结合工艺

将胰激肽原酶粗品溶于10 %饱和度的硫酸铵溶液，离心取上清液，加入硫酸铵粉末使溶液达到35 %饱和度，再离心取上清液，加入硫酸铵达70 %饱和度，离心，沉淀溶解后进行疏水色谱。

以Buty1 Sepharose FF为介质；平衡缓冲液为10 mmol/L Na2HPO4/ NaH2PO4+1.0 mol/L (NH4)2SO4（pH 6.5）；洗脱缓冲液为10 mmol/L Na2HPO4/ NaH2PO4（pH 6.5）。通过盐析和柱色谱可除去大部分杂质，得到比活大于500 u/mg的胰激肽原酶，收率为85.6 %[8]。

由于疏水色谱在较高盐浓度条件下操作，此工艺经过盐析后的上清液中盐浓度较高，70%硫酸铵盐析后的沉淀含有较多的盐，其溶解液不宜作离子交换色谱，但在溶解液中再加少许盐调整后可直接作为疏水色谱的进料。疏水色谱收集的非目标蛋白质洗脱液可作为分离其他酶如弹性酶，糜胰蛋白酶等的原料。

1.4联产工艺

周祖荫等[9]报道了一种胰激肽原酶、弹性酶和糜胰蛋白酶的联产工艺。以猪胰脏的丙酮脱水干燥粉为原料，用适当溶液提取，提取液中加CM-纤维素吸附，对吸附后CM-纤维素的洗脱液用丙酮沉淀，得糜胰蛋白酶。CM-纤维素吸附后的溶液中加DEAE-纤维素吸附，洗脱液用丙酮沉淀，得胰激肽原酶。猪胰脏丙酮脱水干燥粉经提取后的残渣，再用另一种溶液提取，提取液中加CM-纤维素吸附，洗脱液用丙酮沉淀，得弹性酶。

1.5 其他相关问题和讨论

制备胰激肽原酶粗品的方法较多[1]，主要可分为两类：一类是用丙酮、乙醇等有机溶剂进行分级沉淀；再一类是由硫酸铵、硫酸镁或醋酸镁等进行分段盐析。两类方法相结合可获得良好的效果。如胰脏经丙酮脱水的粉末，先用较低浓度的醋酸镁盐析，溶液调pH至7.5～8.0使胰激肽原酶充分溶解，再用丙酮分级沉淀，可制得质量较好的粗品，且收率较高。

粗品的纯化（精品的制备），关键是筛选良好的吸附剂。无机吸附剂如羟磷灰石，离子交换纤维素，具有凝胶色谱作用的离子交换剂，亲和色谱介质等有多种可供选用。尤其是将数种吸附剂有机结合，可制得纯度较高的产品。

胰激肽原酶的稳定性与其制剂的制备有关。最近的研究表明[10]，在糖类增强胰激肽原酶稳定性方面，海藻糖和透明质酸组合物的作用最佳。

2质量控制

2.1药品标准的修订

胰激肽原酶的国家药品标准于1998年首次颁布[11]，2006年颁布修订件[2，12，13]。1998年的标准规定“每1 mg蛋白的效价不得少于300单位”，修订件规定“每1 mg蛋白含胰激肽原酶的效价不得少于300单位（供口服用）和600单位（供注射用）。”胰激肽原酶肠溶片的规格1998年的标准为20单位和60单位两种，修订件为60单位和120单位2种。注射用胰激肽原酶的规格未变，均为10单位，20单位和40单位3种。由此可知，标准修订后对原料药的效价要求提高，口服制剂的剂量增大。

2.2鉴别

鉴别实验之一是测定水解速率，是指在规定的条件下胰激肽原酶与底物N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐（BAEE）酶解反应的速率。一种酶对特定底物的水解速率是恒定的，故可用于鉴别胰激肽原酶。

胰激肽原酶可催化水解底物BAEE生成N-苯甲酰-L-精氨酸和乙醇，BAEE与其水解产物的吸光系数（specific absorbance）明显不同，后者较大，故酶作用后吸收度增大[3]。据此，测定不同时间的吸光度值，即可计算出水解速率。标准规定，在规定的条件下水解速率应为0.12~0.17。

原部颁标准[11]规定在鉴别实验中，需加胰蛋白酶抑制剂，以抑制混在胰激肽原酶中的胰蛋白酶，因为胰蛋白酶也可与BAEE反应，且其水解速率较高，使测得的表观水解速率值偏高，不能确切反映胰激肽原酶的水解速率。

新修订的标准[2]中取消了加胰蛋白酶抑制剂，主要是因为胰激肽原酶的纯度提高，微量和胰蛋白酶对水解速率的测定影响很小。

鉴别实验之二是用高效液相色谱（HPLC）法。色谱图中供试品溶液主峰的保留时间与对照品溶液主峰的保留时间偏差应在±1 min以内，此鉴别方法专属性较强。

2.3检查

原料药的检查项目主要是杂质检查和纯度检查。

杂质检查除一般常规项目外，主要是脂肪和蛋白酶的检查。原料药来源于猪胰脏，而猪胰脏中难免存在较多的脂肪，虽然在制备过程中去除了绝大部分，但仍有遗留。标准规定原料药每1.0 g中遗留脂肪不得超过5 mg。检查蛋白酶系指自猪胰脏制备时混杂在胰激肽原酶中的其他蛋白酶。用酪蛋白作底物，是因猪胰脏中的大多数蛋白酶均能水解酪蛋白，而胰激肽原酶则与酪蛋白几乎不起作用。酪蛋白经水解生成的肽和氨基酸，可使280 nm波长处测得的吸光度增大，故用紫外分光光度法测定吸光度。在规定的条件下，测得的吸光度越高，表明其他蛋白酶的量越大。标准中规定吸光度不得超过0.2。

纯度检查即用上述鉴别实验之二的HPLC法，填充介质为疏水性凝胶，通过疏水色谱分离原料药的组成成分。以含1.7 mol/L硫酸铵的磷酸盐缓冲液为流动相A配制供试品溶液和对照品（纯度大于95 %）溶液。以上述磷酸盐缓冲液为流动相B，供洗脱用。分别取流动相A，供试品溶液及对照品溶液注入色谱仪，然后进行梯度洗脱，流动相B的比例从0 %增至100 %，记录色谱图。按面积归一化法计算与对照品溶液主峰保留时间一致的主峰面积不得低于65 %（供口服用）或90 %（供注射用）。由此可知，此色谱分离的原理即在高盐浓度条件下进行吸附，然后降低盐浓度进行洗脱。

除原料药外，对其制剂即胰激肽原酶肠溶片和注射用胰激肽原酶，也需进行纯度检查，以防止用纯度低的原料制成制剂。

2.4 效价测定

效价测定的原理，即胰激肽原酶可催化水解底物BAEE生成N-苯甲酰-L-精氨酸，而后者的吸光系数较大。具体操作是在规定条件下，在底物溶液中加入供试品溶液或对照品溶液，按照紫外-可见分光度法以底物溶液为空白，读取1 min的吸光度A0和3 min的吸光度A，分别求得供试品溶液和对照品溶液的ΔA值（ΔA=A-A0），即可用下式计算效价：

然后按氮测定法测定供试品的蛋白质含量，由测得的酶活性和蛋白质含量即可计算每1mg蛋白质中含胰激肽原酶的单位数。

2.5其他相关问题的讨论

杨化新等[14]认为，药品标准所用的胰激肽原酶活性测定方法有一定的缺点，如需要对照品，并对供试品纯度有一定的要求等，故研究了国际药学联合会（FIP）推荐的电位滴定法。此法的基本原理是胰激肽原酶在一定条件下能水解BAEE，水解产物使溶液的pH值下降，加入标准碱液后使溶液的pH又恢复到原值，水解反应继续进行，在一定时间内根据供试品消耗的碱溶液体积，即可推算出酶活性。

如上所述药品标准，电位滴定法并未被部颁标准和国家药品标准修订件采用。笔者认为，其原因是胰激肽原酶主要是日本应用较多[15]，我国药品标准基本上与日本生产企业的标准一致，这有利于贸易与交流。日本的制剂较多，有的还可借鉴。利用胰激肽原酶能防治末梢循环障碍类疾病的机制，还可研究一些新用途的制剂。

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