二仙汤对去势后大鼠骨质疏松的影响研究
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[摘要] 目的：研究二仙汤对去势大鼠骨质疏松的影响及机制。方法：将50只SD雌性大鼠随机分为5组，连续给药12周。第6周测尿脱氧吡啶酚（DPD），尿肌酐（U-Cr），U-DPD/Cr。第12周取血清测血钙（S-Ca）、血磷（S-P）、骨钙素（BGP）、I型前胶后羧基端前肽（PICP）、I型胶原交联N末端肽；取股骨测量骨密度（BMD）并行股骨形态学分析。结果：各组S-P无统计学意义。模型组与假手术组比较，DPD，U-Cr，U-DPD/Cr，NTX显著升高， S-Ca，BGP，PICP显著降低，BMD降低；与模型组比较，二仙汤各组和雌激素组DPD，U-Cr，U-DPD/Cr，NTX显著降低，S-Ca，BGP，PICP显著升高，BMD升高。结论：二仙汤可以促进骨形成，抑制骨吸收，维持骨再建过程中骨代谢平衡，提高骨密度，从而起到抗骨质疏松的疗效和骨保护作用。
[关键词] 二仙汤；骨质疏松；骨密度；脱氧吡啶酚；I型前胶后羧基端前肽；I胶交联N末端肽
[收稿日期] 2014-05-08
[通信作者] 王桂敏，Tel：13840629555，E-mail：
[作者简介] 李旭斌，医师，E-mail：
骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以低骨量，骨组织的微结构破坏为特征，导致骨骼脆性增加和易骨折的全身性疾病[1]。随着全球人口老龄化，骨质疏松在全世界发病率逐年上升，绝经后妇女发病率更高，其特征是骨量减少，骨组织的显微结构改变，骨折的危险性增大。临床治疗药物主要包括：激素调节药物（雌激素等）、促进骨形成药物（甲状旁腺激素）、促进骨矿化药物（维生素D、钙剂）等。这些药物对治疗OP有效，但伴随有严重副作用，如激素长期治疗出现的血凝状态、高血压、水肿[2]、子宫内膜癌、乳腺癌等[3]。中医药治疗原发性骨质疏松注重于整体调节，调动内因，作用于多个环节，在治疗上有较大优势[4-7]。二仙汤是张伯纳教授20世纪50年代经过反复筛选验证而研制出的一剂名方，该方临床应用几十年，疗效确实，现代研究证明二仙汤可以增加雌激素分泌，增加骨形成和降低骨吸收，从而起到抗骨质疏松的疗效和骨保护作用。本文通过建立去势后大鼠骨质疏松模型，检测生化指标及骨密度等变化，研究二仙汤对去势后大鼠骨质疏松的影响，探讨可能存在的作用机制，为临床治疗绝经后骨质疏松寻求理论依据。
1 材料
1.1 药品及试剂 二仙汤由辽宁医学院附属第一医院中药局提供。DPD，U-Cr，BGP，PICP，NTX检测试剂盒均购自Sigma公司；10%水合氯醛溶液、4%多聚甲醛溶液购自辽宁医学院科学实验中心；尼尔雌醇购自北京益民药业（批号0904100）。
1.2 仪器 LEICA-CM1800石蜡切片机（德国莱卡）；JC303-4电热恒温培养箱（上海嘉和仪器设备厂）；TGLL-18G高速冷冻离心机（太仓市医疗器械厂）；7170A全自动生化分析仪（日本Olympus）；显微镜（MICROPHOT-FXA）；QDR-4500A双能X线骨密度仪（美国HOLOGIC）；550型酶标仪（美国Bio-Rad）。
1.3 动物 3个月龄雌性SD大鼠，体重200～220 g，由辽宁医学院科学实验中心提供，动物合格证号LJ08023。
2 方法
2.1 药物制作 二仙汤由仙茅20 g、淫羊藿20 g、巴戟天15 g、当归15 g、黄柏15 g、知母15 g，沸水煎煮，药液放入浓缩缸内浓缩。其推荐临床剂量为按60 kg人计为每日60 g（生药），折算为大鼠剂量相当于生药6.3 g・kg-1，中药低剂量组每天用药量相当于含生药量6.3 g・kg-1；中药高剂量组含生药量是低剂量组的4倍，相当于含生药量25.12 g・kg-1。按照人与大鼠体表面积比例，以上药物给药容积为1.79 mL，灌胃，每日1次。雌激素组给予1.5 mg・kg-1的尼尔雌醇，用生理盐水稀释成等体积混悬液。
2.2 动物分组及模型制做 将50只健康成年SD大鼠，按完全随机数字法分为5组，每组10只：假手术组（Sham组）、模型组（OVX组）、雌激素（EST组）、二仙汤低剂量组（EXD/L组）、二仙汤高剂量组（EXD/H组），将各组大鼠用 10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL・kg-1体重），以俯卧姿势固定在手术架上，在季肋，腋中线和脊柱外侧入路暴露双侧卵巢，除假手术组仅暴露外，其余各组均切除双侧卵巢。术后肌注青霉素1万U/只，连用3 d。术后第2天开始行阴道细胞涂片检查，每天1次，连续5 d，阴道上皮角化细胞无周期性变化，证明卵巢去除成功。
2.3 给药方式 按大鼠体重计算每日用药量；假手术组和模型组每日给予1.79 mL等量生理盐水；雌激素组灌胃尼尔雌醇1.5 mg・kg-1，1次/3 d，其余2 d灌胃等量生理盐水；中药低剂量组每日灌胃1.79 mL中药（含3.04 g生药），中药高剂量组每日灌胃1.79 mL中药（含9.12 g生药），每天1次，连续12周。
2.4 血、尿生化指标 第6周将大鼠禁食禁水1 d，放入代谢笼，收集尿液，用消毒瓶装好待测。用ELISA法测定脱氧吡啶酚（DPD）、尿肌酐（U-Cr）。12周后颈动脉穿刺抽血，用离心机3 000 r・min-1离心10 min，取上层血清。-20 ℃环境保存待测。将血清用全自动生化分析仪测定血钙（S-Ca）、血磷（S-P），ELISA法测定骨钙素（BGP）、I型前胶后羧基端前肽（PICP）、I型胶原交联N末端肽（NTX）。均用550型酶标仪读取数值（按说明书操作）。
2.5 骨密度（BMD）检测 12周取血后处死大鼠剔出双侧股骨分别保存。用双能X线骨密度诊断仪对大鼠左侧股骨近端干骺端进行扫描测定，扫描宽15 cm，速度80 mm・s-1，分辨率310 mm×310 mm。检测BMD值。
2.6 骨病理形态学检测 取右侧股骨髁经脱钙、脱水、石蜡包埋处理后，取股骨髁部相同部位横向切片，制成5 μm 厚组织切片，行HE染色，在光镜下观察各组切片组织病理学的变化。
2.7 统计学处理 数据用表示，采用SPSS 17.0统计软件进行分析处理。用单因素方差分析，行多重性组间差异性比较，P
3 结果
3.1 对大鼠DPD，U-Cr，U-DPD/Cr的影响 与OVX组比较，Sham组、EST组、EXD各组DPD，U-Cr，U-DPD/Cr含量显著降低；与EXD/H组比较，EST组含量降低、EXD/L组含量升高，见表1。
3.2 对大鼠S-Ca，S-P，BGP，PICP，NTX的影响 各组S-P无明显差异。与OVX组比较，Sham组、EST组、EXD各组BGP，NTX含量显著降低（P
3.3 对大鼠股骨骨密度的影响 OVX组与Sham组比较，骨密度明显降低（P
3.4 病理切片特征 假手术组（Sham组）可见骨组织结构完整，骨小粱致密粗壮，数目多，形态规则，间隙适中，排列齐整；模型组（VOX组），骨小梁稀疏，骨小梁间有断裂并且分离，间隙增大，排列紊乱，骨板层结构疏松，骨质疏松特征明显；雌激素组（EST组），骨小梁粗壮，结构完整，形态规则，骨小粱排列致密，且骨小梁数目明显多于模型组；二仙汤高剂量组（EXD/L组 ）可见骨小梁致密丰实，间距较窄，形态结构规整，宽度和间隙与假手术组和雌激素组接近，见图1。
4 讨论
绝经后骨质疏松是老年妇女常患的一种代谢性骨病，患病率高。雌激素水平的明显下降是导致骨质疏松的主要原因[8]。现代研究证明二仙汤可以增加雌激素分泌，增加血清碱性磷酸酶活性，增加降钙素的浓度，增加骨形成和降低骨吸收，从而起到抗骨质疏松的疗效和骨保护作用[9-12]。
骨代谢处在骨吸收和骨形成的动态平衡中，骨吸收绝对或相对增加是导致骨量丢失的直接原因[13]。反映骨形成的指标有：血清ALP（碱性磷酸酶）、血清 BALP（骨碱性磷酸酶）、血清 BGP （骨钙素）、血清 PICP（I型前胶后羧基端前肽）和 PINP（I型原胶原氨基端前肽）、血清 MMPs （基质金属蛋白酶）；反映骨吸收的指标有：血清HOP（羟脯氨酸）、血清PYD（吡啶啉）和血清 DPD（脱氧吡啶啉）、血清 TRACP（抗酒石酸酸性磷酸酶）、血清 CTX-I（I 型胶原羧基端交联肽）和血清 NTX-I（I 型胶原氨基端交联肽）等[14-15]。在 Blumsohn A等[16]的研究中发现PICP比T-ALP和B-ALP更好。本实验中OVX组与Sham组比较PICP含量显著降低，雌激素组和二仙汤组与OVX组比较明显升高，表明尼尔雌醇和二仙汤均有较强的升高PICP，促进骨形成的作用。DPD是骨中细胞外基质成熟胶原的不可还原的代谢产物，不经过肝脏的进一步降解，直接排泄于尿中，是骨吸收的灵敏和特异性指标，可作为筛选骨质疏松高危人群和监测雌激素疗效的有用指标，能可靠的反映骨转换状况[17]。本实验中OVX组与Sham组比较尿DPD及U-DPD/Cr含量显著升高，雌激素组和二仙汤组与OVX组比较DPD及U-DPD/Cr明显下降，表明尼尔雌醇和二仙汤均有较强的降低尿DPD的作用，从而起到抑制骨吸收的作用。I型胶原交联N末端肽（NTX）是反映骨吸收和骨转移的敏感指标，较其他更为特异和灵敏[17]。本实验中OVX组与Sham组比较NTX含量显著升高，雌激素组和二仙汤组与OVX组比较明显下降，表明尼尔雌醇和二仙汤均有较强的降低NTX的作用，从而表明存在抑制骨吸收的作用。二仙汤高剂量比低剂量下降作用更明显。骨钙素（BGP）是由成骨细胞分泌的维生素K依赖型钙结合蛋白，血清骨钙素水映新形成但未结合至矿化部位的骨钙素，高转换型骨丢失情况下，血中BGP含量增加。去卵巢后大鼠骨质疏松为高转换型骨质疏松，血清骨钙素含量增加[18]，本研究也证明了这一点。同OVX组比较，尼尔雌醇组和二仙汤组血清骨钙素含量均下降，表明二仙汤和尼尔雌醇可以降低骨转换率。
本实验发现，雌激素组、二仙汤组均能不同程度的提高去势大鼠S-Ca水平（P
大鼠去卵巢后由于雌激素不足，导致骨吸收超过骨形成，出现高转换型骨质疏松。尼尔雌醇为雌激素类抗骨质疏松药物，实验结果提示通过抑制骨吸收，抑制骨转换，增加骨量来达到抗骨质疏松的作用。本研究结果表明，二仙汤对去势大鼠有抗骨质疏松作用，该作用是通过促进骨形成，抑制骨吸收，降低骨转换率，保持骨量的正常水平、提高骨密度来实现的，从而起到抗骨质疏松的疗效和骨保护作用。
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