硫磺熏蒸对白芷中欧前胡素含量的影响

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摘要：目的 研究硫磺熏蒸对白芷中欧前胡素含量变化的影响。方法 产地采收白芷的新鲜样品，每份样品均一半按照传统方法进行硫磺熏蒸，另一半切片后自然晾干（非硫磺熏蒸）。采用高效液相色谱法（HPLC）进行白芷中欧前胡素的含量测定，C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-水，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，检测波长选择210～800 nm范围内的最大绘图。结果 收集了29批新鲜白芷的根，非硫磺熏蒸和硫磺熏蒸加工获得的白芷药材中欧前胡素的平均含量分别为0.202%、0.120%；与非硫磺熏蒸比较，硫磺熏蒸加工获得的白芷药材中，欧前胡素的含量下降了6.77%～77.56%，平均下降39.86%。结论 白芷中欧前胡素的含量经硫磺熏蒸后明显下降，提示白芷的生产和加工不宜采用硫磺熏蒸技术。

关键词：白芷；硫磺熏蒸；欧前胡素；产地加工；含量测定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.08.025

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）08-0085-04

Effects of Sulphur Fumigation on Content of Imperatorin in Angelicae Dahuricae Radix （Baizhi） WU Xiao-yi， CHAO Zhi-mao， WANG Meng-yuan， WANG Chun， SUN Wen （Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

Abstract：Objective To study whether sulphur fumigation can cause changes to the content of imperatorin in Angelicae Dahuricae Radix （Baizhi）. Methods The fresh samples of Angelicae Dahuricae Radix were collected from some cultivation bases. Half of each batch root was fumigated with sulfur according to the conventional method， and another half was cut into slices and dried naturally （i.e. without sulfur fumigation）. The content of imperatorin was determined by HPLC on C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） with a gradient mobile phase of acetonitrile-water solution system at the follow rate of 1.0 mL/min， 35 ℃ of the column temperature， and the max plot in 210-800 nm of the detective wavelength. Results Totally 29 batches of fresh roots of Angelica dahurica were collected. The average contents of imperatorin were 0.202% in the Angelicae Dahuricae Radix with sulfur fumigation and 0.120% in the Angelicae Dahuricae Radix without sulfur fumigation. Compared with the corresponding samples without sulfur fumigation， the content of imperatorin in every Angelicae Dahuricae Radix with sulfur fumigation decreased by 6.77%-77.56% with an average decrease of 39.86%. Conclusion The content of imperatorin decreased significantly in every batch of Angelicae Dahuricae Radix with sulphur fumigation. It shows that the sulphur fumigation method was not suitable for producing and processing Angelicae Dahuricae Radix from fresh roots of A. dahurica.

Key words：Angelicae Dahuricae Radix；sulfur fumigation；imperatorin；cultivation-base processing；content determination

中药白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook. f.或杭白芷

基金项目：人力资源和社会保障部留学人员科技活动项目（人社厅函[2011]508号）

通讯作者：巢志茂，Tel：010-64014411-2869，E-mail：chao

A. dahurica （Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook. f. var. formosana （Boiss.） Shan et Yuan的干燥根，性温味辛，归胃、大肠、肺经，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓的功效，主要用于感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻渊、牙痛、带下、疮疡肿痛等症[1]。香豆素类成分是白芷的主要化学成分，欧前胡素为白芷的主要活性香豆素类成分。欧前胡素能显著延长小鼠醋酸扭体反应的潜伏期，使扭体次数显著减少[2]，且能明显缓解家兔回肠平滑肌痉挛[3]，体现镇痛和解痉活性。包括欧前胡素在内的白芷中的总香豆素还具有抗肿瘤、抗菌和光毒等活性[3-5]。欧前胡素的含量测定是我国药典对白芷的质量控制指标之一[1]。

白芷的传统产地加工方法主要采用硫磺熏蒸法，以达到药材快速干燥的目的，并解决药材颜色发黄和生虫等问题[6]。近年的研究表明，白芷经硫磺熏蒸后，香豆素类成分的总含量显著下降，镇痛活性也显著降低[7-9]。本试验收集29批白芷的新鲜根，每批均采用硫磺熏蒸和切片后自然阴干2种产地加工方法，对干燥后的样品进行欧前胡素含量测定，进一步为硫磺熏蒸与否的白芷药材质量评价提供参考依据。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）：SPD-M20A二极管阵列检测器（PDA），SIL-20A自动进样器，DGU-20As在线脱气机，CTO-10ASvp柱温箱和岛津LC-solution工作站；HHS型电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；Sartorius CP225D型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；FW100高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。

欧前胡素对照品（成都普思生物科技有限公司，批号101228-01），乙腈（色谱纯，Merck公司），甲醇（色谱纯，Merck公司），纯水（娃哈哈纯净水），其他试剂均为分析纯。

2012年10月下旬，叶黄时，除去地上部分，机器或人工挖出白芷的根部，抖尽泥沙，除去残留的泥土，晾干。每个地块选择大小一致、无病虫害、无机械损伤的白芷6根，其中3根进行48 h硫磺熏蒸，直到出现“淌泪”为止，即药材变软、表皮有少量液体渗出，达到传统的硫磺熏蒸产地加工要求，随后将其切片，置于阴凉通风处晾干，即为硫磺熏蒸后的白芷药材（S）；另3根趁新鲜直接切片后，置于阴凉通风处晾干，即为非硫磺熏蒸的白芷药材（NS）。采集地为河北省安国市南徐辛庄村等自然村的白芷种植地，每个村根据地块采集1～3批样品，共采集15个村的29批样品。经中国中医科学院中药研究所巢志茂研究员鉴定，所有样品均为伞形科当归属植物白芷Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook. f.的根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Diamonsil（R）-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱（0～10 min，10%～20%乙腈；10～18 min，20%～35%乙腈；18～48 min，35%～55%乙腈；48～68 min，55%～75%乙腈；68～75 min， 75%～90%乙腈）；柱温35 ℃，波长选用210～800 nm的MaxPlot色谱图，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。色谱图见图1。

A

B

注：A.对照品；B.供试品；1.欧前胡素

图1 白芷中欧前胡素HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

精密称定欧前胡素4.98 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.199 2 mg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取白芷药材，粉碎（过80目筛），精密称取1 g，置于100 mL平底烧瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定质量，水浴加热回流提取2 h，冷却后补足减失的质量，过滤，取续滤液。精密量取5 mL续滤液，减压回收溶剂至干，用甲醇转移并定容至5 mL，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取欧前胡素对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL，定容至10 mL容量瓶中，配制成0.009 96、0.019 92、0.039 84、0.059 76、0.079 68、0.099 6 mg/mL的溶液，依次进样10 μL，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=5 217 732X-47 565（r=0.999 3），欧前胡素进样量在0.099 6～0.996 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液（0.199 2 mg/mL）10 μL，连续进样6次，测定欧前胡素峰面积值，结果其RSD=0.96%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液（No.22NS），室温放置，分别在0、2、4、6、8、12 h进样分析，进样量为10 μL，测定欧前胡素峰面积值，其RSD=1.30%（n=6），表明供试品溶液12 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

精密吸取同一供试品（No.22NS）粉末6份，按上述供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，分别进行测定，计算欧前胡素的平均含量为0.252%，RSD=1.74%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取白芷样品（No.22NS）粉末6份，每份约0.5 g，精密称定，分别精密加入2.606 mg/mL欧前胡素的70%乙醇溶液0.5 mL，按照供试品溶液的制备方法制备，并测定欧前胡素的含量，计算加样回收率平均为100.32%，RSD=2.29%（n=6），见表1。

表1 白芷中欧前胡素加样回收率试验

称样量

（g） 样品中

含量（mg） 加入量

（mg） 测得量

（mg） 回收率

（%） 平均回

收率（%） RSD

（%）

0.508 3 1.281 1.303 2.619 102.69

0.498 4 1.256 1.303 2.538 98.39

0.503 1 1.268 1.303 2.600 102.23 100.32 2.29

0.504 2 1.271 1.303 2.604 102.30

0.501 9 1.265 1.303 2.545 98.23

0.500 1 1.260 1.303 2.538 98.08

2.9 样品含量测定

分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，使用外标法计算欧前胡素的含量，并计算硫磺熏蒸样品中欧前胡素下降率，结果见表2。

表2 硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸白芷中欧前胡素含量及下降率比较

编号 样品来源 欧前胡素含量（g/100 g） 欧前胡素下降率

（%） 编号 样品来源 欧前胡素含量（g/100 g） 欧前胡素下降率

（%）

NS S NS S

1 南徐辛庄村 0.080 0.065 18.75 16 海市村 0.263 0.140 46.77

2 南徐辛庄村 0.109 0.069 36.70 17 海市村 0.331 0.089 73.11

3 南徐辛庄村 0.150 0.083 44.67 18 海市村 0.150 0.121 19.33

4 霍庄村 0.194 0.103 46.91 19 里河村 0.215 0.106 50.70

5 南王买村 0.187 0.113 39.57 20 里河村 0.203 0.144 29.06

6 南王买村 0.170 0.102 40.00 21 里河村 0.138 0.059 57.25

7 南王买村 0.150 0.111 26.00 22 南辛庄村 0.252 0.108 57.14

8 刘庄村 0.106 0.071 33.02 23 小王买村 0.177 0.098 44.63

9 王庄村 0.133 0.121 9.02 24 小王买村 0.252 0.139 44.84

10 王庄村 0.155 0.104 32.90 25 大李庄村 0.228 0.093 59.21

11 王庄村 0.228 0.127 44.30 26 行唐村 0.235 0.148 37.02

12 辛庄村 0.363 0.294 19.01 27 小南流村 0.401 0.090 77.56

13 辛庄村 0.273 0.162 40.66 28 霍庄村 0.195 0.087 55.39

14 焦街村 0.325 0.303 6.77 29 辛庄村 0.112 0.097 13.39

15 郑庄村 0.178 0.085 52.25

注：欧前胡素下降率（%）=[非硫磺熏蒸白芷（NS）样品中欧前胡素含量-硫磺熏蒸白芷（S）样品中欧前胡素含量]÷NS样品中欧前胡素含量×100%

3 讨论

3.1 提取方法、溶剂、时间的选择

本试验考察了超声提取法、回流法和冷浸法，结果表明回流提取法测得的欧前胡素的含量较高，因此选择回流法；考察了甲醇、乙醇（100%、70%、50%、30%，V/V）的提取效果，结果表明70%乙醇和甲醇提取欧前胡素的量较高，但从经济合理和环保的角度考虑，选择70%的乙醇；对回流法的提取时间（1、2 h各提取1次，1 h提取2次）进行考察，结果表明，一次提取2 h后测得的含量较高。总体而言，采用70%乙醇加热回流提取2 h。

3.2 白芷硫磺熏蒸前后欧前胡素含量的比较

从表2的含量测定结果可以看出，NS白芷中欧前胡素的含量为0.080%～0.401%，平均含量0.202%，均符合2010年版《中华人民共和国药典》白芷药材中“欧前胡素不得少于0.080%”的规定[1]；S白芷中欧前胡素的含量为0.060%～0.303%，平均含量0.120%，低于药典规定的样品有4批，占全部29批样品的14%。全部29批样品中，硫磺熏蒸后欧前胡素的含量均显著低于对应的NS样品，下降率为6.77%～77.56%，平均下降39.86%。该结果与文献[8]报道的硫磺熏蒸48 h后，白芷中总香豆素含量下降77.9%的结果具有一致性。至于硫磺熏蒸后欧前胡素的含量下降率不一致的现象，推测是由于从各地块获得的白芷根的粗细、长短不一，使熏蒸程度不一致造成的。硫磺熏蒸引起欧前胡素含量下降，甚至低于我国药典的含量基本规定，说明产地加工过程不适合采用硫磺熏蒸。

有文献报道，白芷硫磺熏蒸后，对冰醋酸诱导的小鼠疼痛疗效减弱，但没有阐明该作用减弱的原因[9]。由于欧前胡素是白芷镇痛的主要有效成分，因此，本研究从硫磺熏蒸后欧前胡素含量的显著下降可以阐明白芷镇痛作用减弱的机理。

显然，不管是从有效成分含量还是药理活性的角度，白芷产地加工不适宜进行硫磺熏蒸。

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（收稿日期：2014-01-25；编辑：陈静）