藏药多刺绿绒蒿的化学成分研究

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[摘要] 研究藏药多刺绿绒蒿的化学成分。利用硅胶、Sephadex LH-20、ODS等色谱技术进行分离纯化，通过1H，13C-NMR等理化数据及与文献相对照进行结构鉴定，采用MTT法对部分化合物进行体外细胞毒活性评价。从多刺绿绒蒿的乙醇提取物中分离得到9个化合物，分别鉴定为马齿苋酰胺E（1），N-反式对羟基肉桂酰基-对羟基苯乙胺（2），金圣草黄素（3），芹菜素（4），大风子素（5），对羟基肉桂酸葡萄糖酯（6），stigmast-5-ene-3β-ylformate（7），3β-hydroxy-7α-ethoxy-24β-ethylcholest-5-ene（8），β-谷甾醇（9）。化合物6～8为首次从该属中分离获得，1，3为首次从该种植物中分离得到。化合物1对人肝癌细胞系HepG2具有显著的细胞毒活性。

[关键词] 藏药；绿绒蒿属；多刺绿绒蒿；化学成分；细胞毒活性

藏药是藏族人民的传统药学体系，也是我国较为完整、较有影响的民族药之一，其种类仅次于中药，居于我国四大民族药之首。藏药在2 000多年的历史中对藏族藏区人民的繁衍生息起到了巨大作用，目前仍是我国藏区和藏族人民医疗健康的重要保障。青藏高原独特的高海拔（平均3 800 m）、强紫外线、高寒、干旱与缺氧等地理环境，造就了藏药材不同于一般陆地植物的次生代谢成分并赋予其独特的治疗效果[1]。随着世界范围内正恢复对中医药等传统医学的兴趣，从传统藏药中研究和开发新药成为我国当前中医药研究的重点和热点之一。

绿绒蒿属藏药是青藏高原最具特色的品种之一，本属植物全世界共49种，其中48种分布在喜马拉雅山地区，我国有38种，多分布在、青海、云南等地，生长在海拔3 000 m以上[2-3]。本属植物不仅色彩艳丽、姿态优美为人们喜欢，素有“仙草”、“喜马拉雅罂粟”等雅称，是、云南地区的标志性植物和的十大观赏花卉之一。更是我国地区的重要药用资源，如多刺绿绒蒿、全缘绿绒蒿等作为藏药广泛使用，具有清热解毒等作用[3-4]。

多刺绿绒蒿Meconopsis horridula Hook. f. & Thomson为绿绒蒿属一年生草本，全体被黄褐色或淡黄色、坚硬而平展的刺，刺长0.5～1 cm。生长在海拔3 600～5 400 m以上的山坡石缝中。其花朵大，多蓝灰色或绿色[2]。据藏药典籍《晶珠本草》记载：多刺绿绒蒿利头伤，治骨裂抬升软骨；全草入药，具有活血化瘀、镇痛的功效，藏医用其治疗头痛，骨折、跌打损伤等[5]。目前对多刺绿绒蒿的化学成分研究较少，前人从本种植物中报道了15个黄酮[6-8]，6个生物碱[8-9]和1个其他类成分[6]。作为抗心肌缺血民族药的药效物质研究的一部分，本课题对多刺绿绒蒿乙醇提取物的部分流分进行了化学成分研究，从中分离得到9个化合物。经1H，13C-NMR等理化数据分析及与文献相对照，分别鉴定为马齿苋酰胺E（1），N-反式对羟基肉桂酰基-对羟基苯乙胺（2），金圣草黄素（3），芹菜素（4），大风子素（5），对羟基肉桂酸葡萄糖酯（6），stigmast-5-ene-3β-ylformate（7），3β-hydroxy-7α-ethoxy-24β-ethylcholest-5-ene（8），β-谷甾醇（9）。其中化合物6～8为首次从该种属中分离得到，1，3为首次从该种植物中分离得到。同时，采用MTT法测定了1～4对人肝癌细胞系HepG2的细胞毒活性。

1 材料

Varian Inova-500型核磁共振仪；Agilent 6320型离子阱液质联用仪；Trace GC-MS质谱仪；VG Zabspec型高分辨质谱仪（使用FAB离子源）。显微熔点测定仪XT4（北京科仪电光仪器厂）；SANYO公司MCO-18AIC细胞培养箱；Motic公司AE2000倒置荧光显微镜；ESCO公司OptiMair超净工作台；瑞士TECAN公司M1000型多功能酶标仪；DMEM细胞培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；噻唑兰购自北京鼎国生物技术有限公司；柱色谱所用Sephadex LH-20为瑞典Amersham Biosciences 公司产品；ODS C18（40～63 μm）为德国Merck公司产品；柱色谱硅胶（200～300目），制备薄层色谱硅胶板GF254（0.04 cm×20 cm×20 cm）以及薄层色谱硅胶板GF254均为青岛海洋化工厂产品。提取和分离中所用化学试剂均为分析纯，为北京化工厂产品。

多刺绿绒蒿药材于2012年8月采自山南地区错那县勒布沟，经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定为罂粟科绿绒蒿属植物多刺绿绒蒿M. horridula，凭证标本（No. MH201208）存放于北京中医药大学中药现代研究中心。

2 提取与分离

多刺绿绒蒿干燥地上部分（25 kg），用10倍量95%乙醇提取2次，80%乙醇提取1次，每次2 h。合并提取液减压回收乙醇后得到总浸膏（约3.5 kg），加水分散并以稀HCl调pH至2.0后，分别以石油醚和乙酸乙酯萃取得到各自萃取部位，水层加NH3·H2O调pH至10.0后，以正丁醇萃取，得到正丁醇部位。

乙酸乙酯部位（120 g）经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇（50∶1～0∶1）梯度洗脱，TLC检测，得到10个流分（Ea～Ej）。Ef经硅胶柱色谱分离，氯仿-乙酸乙酯（2∶1～1∶5； 1%乙酸）梯度洗脱，得到3个流分（Efa～Efc）。Efb经Sephadex LH-20（甲醇）纯化，得到化合物2（5 mg）。Efc经Sephadex LH-20（甲醇）纯化，得到化合物1（1 g）。Eg经硅胶柱色谱分离，氯仿-丙酮（6∶1～1∶3； 1%乙酸）梯度洗脱，得到3个流分（Ega～Egc）。Egb经硅胶柱色谱分离，氯仿-乙酸乙酯（6∶1～1∶2；1%乙酸）梯度洗脱，得到4个流分（Egba～Egbd）。Egba经Sephadex LH-20（甲醇）纯化，得到化合物4（1.5 g）。

正丁醇部位（215 g）经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇（50∶1～0∶1）梯度洗脱，得到8个流分（Ba～Bh）。Bc经硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯（5∶1～1∶2）梯度洗脱，得到5个流分（Bca～Bce）。Bce经Sephadex LH-20（氯仿-甲醇 1∶1）纯化，得到化合物3（800 mg）。Bd经硅胶柱色谱分离，氯仿-乙酸乙酯（5∶1～1∶2；1%乙酸）梯度洗脱，得到4个流分（Bda～Bdd），Bdc经Sephadex LH-20（甲醇）和制备薄层色谱（石油醚-丙酮 1∶1； 1%乙酸）纯化，得到化合物5（3 mg）。Be经硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯-甲醇-水（50∶10∶1）洗脱，得到3个流分（Bea～Bec）。Bea经ODS柱色谱分离，甲醇-水（5∶5～10∶0）梯度洗脱，得到化合物6（20 mg）。

石油醚部位（650 g）经硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯（8∶1～1∶0）梯度洗脱，得到19个流分（Pa～Ps）。Pf经硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯（4∶1～1∶3； 1%乙酸）梯度洗脱，得到3个流分（Pfa～Pfc）。Pfb经Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）和制备薄层色谱（石油醚-氯仿 2∶1）纯化，分离得到化合物7（5 mg）。Pg经硅胶柱色谱分离，氯仿-乙酸乙酯（10∶1～0∶1）梯度洗脱，得到5个流分（Pga～Pge）。Pgd经Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）纯化，得到化合物9（50 mg）。Pj经硅胶柱色谱分离，氯仿-丙酮（15∶1～1∶1）梯度洗脱，得到6个流分（Pja～Pjf）。Pjc经Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）分离再经薄层色谱（正己烷-丙酮4∶1）制备，得到化合物8（20 mg）。

3 结构鉴定

化合物1 淡黄色方晶（甲醇）；mp 238～240 ℃；EI-MS m/z 219（M）；1H-NMR（DMSO，500 MHz）δ：1.59（1H，m，H-1a），2.58（1H，m，H-1b），2.21（1H，m，H-2a），2.40（1H，m，H-2b），2.92（1H，m，H-5a），3.96（1H，m，H-5b），2.58（2H，m，H-6），6.50（1H，s，H-7），6.51（1H，s，H-10），4.57（1H，t，J=5.0 Hz，H-10b），8.77（1H，s，8-OH），8.77（1H，s，9-OH）； 13C-NMR（DMSO，125 MHz）δ：27.8（C-1），31.7（C-2），172.5（C-3），37.1（C-5），27.8（C-6），124.0（C-6a），115.8（C-7），144.5（C-8），144.6（C-9），112.1（C-10），128.9（C-10a），56.0（C-10b）。以上数据与文献[10]对照一致，故鉴定化合物1为马齿苋酰胺E（oleracein E）。

化合物2 白色粉末；ESI-MS m/z 284[M+H]+；1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.41（1H，d，J=15.5 Hz，H-2），7.48（1H，d，J=15.5 Hz，H-3），7.43（2H，d，J=8.5 Hz，H-5，9），6.82（2H，d，J=8.5 Hz，H-6，8），3.49（2H，t，J=7.5 Hz，H-1′），2.78（2H，t，J=7.5 Hz，H-2′），7.08（2H，d，J=8.5 Hz，H-4′，8′），6.75（2H，d，J=8.5 Hz，H-5′，7′）； 13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：169.2（C-1），118.5（C-2），141.8（C-3），130.5（C-4），131.3（C-5，9），118.5（C-6，8），160.5（C-7），42.5（C-1′），36.8（C-2′），127.8（C-3′），130.7（C-4′，8′），116.7（C-5′，7′），156.9（C-6′）。以上数据与文献[11]对照一致，故鉴定化合物2为N-反式对羟基肉桂酰基-对羟基苯乙胺[N-（trans-p-coumaroyl）tyramine]。

化合物3 黄色粉末；EI-MS m/z 300（M）；1H-NMR（DMSO，500 MHz）δ：6.85（1H，s，H-3），6.19（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.46（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），7.53（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），6.93（1H，d，J=7.5 Hz，H-5′），7.53（1H，dd，J=7.5，2.0 Hz，H-6′），3.89（3H，s，OCH3），12.96（1H，s，5-OH），10.72（1H，s，7-OH），9.96（1H，s，4′-OH）； 13C-NMR（DMSO，125 MHz）δ：164.1（C-2），103.7（C-3），182.3（C-4），157.8（C-5），99.3（C-6），164.6（C-7），94.5（C-8），161.9（C-9），104.2（C-10），120.8（C-1′），110.7（C-2′），151.2（C-3′），148.5（C-4′），116.2（C-5′），122.0（C-6′），56.4（OCH3）。以上数据与文献[12]对照一致，故鉴定化合物3为金圣草黄素（chrysoeriol）。

化合物4 黄色粉末；EI-MS m/z 270（M）；1H-NMR（DMSO，500 MHz）δ：6.77（1H，s，H-3），6.18（1H，d，J=1.9 Hz，H-6），6.47（1H，d，J=1.9 Hz，H-8），7.92（2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′），6.92（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），12.95（1H，s，5-OH），10.38（1H，s，7-OH），10.38（1H，s，4′-OH）；13C-NMR（DMSO，125 MHz）δ：164.6（C-2），104.1（C-3），182.2（C-4），161.6（C-5），99.30（C-6），164.2（C-7），94.4（C-8），157.5（C-9），103.3（C-10），121.6（C-1′），128.9（C-2′，6′），116.4（C-3′，5′），161.9（C-4′）。以上数据与文献[13]对照一致，故鉴定化合物4为芹菜素（apigenin）。

化合物5 黄色粉末；ESI-MS m/z 463[M-H]-；1H-NMR（DMSO，500 MHz）δ：6.87（1H，s，H-3），6.53（1H，d，J=1.5 Hz，H-6），6.20（1H，d，J=1.5 Hz，H-8），7.61（1H，dd，J=8.5，2.5 Hz，H-2′），7.09（1H，d，J=8.5 Hz，H-5′），7.67（1H，d，J=1.5 Hz，H-6′），7.04（1H，s，H-2″），6.89（1H，s，H-5″），6.81（1H，d，J=8.0 Hz，H-6″），4.96（1H，br s，H-7″），4.28（1H，br s，H-8″），12.91（1H，s，5-OH），9.16（1H，s，7-OH）； 13C-NMR（DMSO，125 MHz）δ：164.2（C-2），103.8（C-3），181.7（C-4），157.3（C-5），98.9（C-6），161.4（C-7），94.1（C-8），162.9（C-9），103.9（C-10），123.7（C-1′），119.9（C-2′），117.5（C-3′），147.1（C-4′），143.6（C-5′），114.8（C-6′），126.9（C-1″），111.8（C-2″），147.6（C-3″），147.1（C-4″），115.3（C-5″），120.6（C-6″），76.3（C-7″），78.0（C-8″），60.0（C-9″），55.7（OCH3）。以上数据与文献[6]对照一致，故鉴定化合物5为大风子素（hydnocarpin）。

化合物6 白色粉末；EI-MS m/z 327（M）；1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.85（1H，d，J=10.0 Hz，H-2，6），7.51（2H，d，J=10.0 Hz，H-3，5），7.76（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），6.40（1H，d，J=16.0 Hz，H-8），5.61（1H，d，J=5.0 Hz，H-1′），3.73（1H，dd，J=5.0，12.0 Hz，H-6′a），3.88（1H，dd，J=2.0，12.0 Hz，H-6′b），3.38～3.49（4H，m，H-2′～5′）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：162.4（C-1），117.7（C-2，6），132.2（C-3，5），127.9（C-4），148.8（C-7），115.4（C-8），168.6（C-9），96.7（C-1′），79.7（C-2′），72.0（C-3′），78.9（C-4′），74.9（C-5′），63.2（C-6′）。以上数据与文献[14]对照一致，故鉴定化合物6为对羟基肉桂酸葡萄糖酯（p-coumaric acid glucosyl ester）。

化合物7 白色粉末；HR-FAB-MS m/z 442.381 8（M）；1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：4.73（1H，m，H-3），5.39（1H，d，J=5.0 Hz，H-6），0.68（3H，s，H-18），1.01（3H，s，H-19），0.92（3H，d，J=6.0 Hz，H-21），0.79～0.88（9H，m，26，27，29-CH3），8.03（1H，s，OCHO）； 13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：37.1（C-1），28.4（C-2），74.1（C-3），38.2（C-4），139.4（C-5），123.1（C-6），32.0（C-7），32.0（C-8），50.2（C-9），39.9（C-10），21.1（C-11），36.7（C-12），42.5（C-13），56.8（C-14），24.4（C-15），26.2（C-16），56.2（C-17），12.0（C-18），19.4（C-19），36.3（C-20），18.9（C-21），34.1（C-22），27.9（C-23），46.0（C-24），29.3（C-25），19.2（C-26），20.2（C-27），23.2（C-28），12.1（C-29），160.8（CO）。以上数据与文献[15]对照一致，故鉴定化合物7为stigmast-5-ene-3β-ylformate。

化合物8 黄色油状液体；EI-MS m/z 458（M）；1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：3.61（1H，m，H-3），5.67（1H，d，J=4.0 Hz，H-6），3.39（1H，m，H-7），0.66（1H，s，H-18），0.98（1H，s，H-19），0.93（3H，d，J=6.0 Hz，H-21），0.82（3H，d，J=7.0 Hz，H-26），0.84（3H，d，J=7.0 Hz，H-27），0.85（3H，t，H-29），3.70，3.37（2H，m，H-1′），1.17（3H，t，J=7.0 Hz，H-2′）； 13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：36.9（C-1），31.7（C-2），71.6（C-3），42.8（C-4），145.5（C-5），122.0（C-6），72.6（C-7），37.5（C-8），42.3（C-9），37.4（C-10），21.0（C-11），39.2（C-12），42.5（C-13），49.1（C-14），24.5（C-15），28.5（C-16），56.0（C-17），11.7（C-18），18.4（C-19），36.4（C-20），19.0（C-21），34.2（C-22），26.4（C-23），46.1（C-24），29.4（C-25），20.0（C-26），19.2（C-27），23.3（C-28），12.2（C-29），64.6（C-1′），16.1（C-2′）。以上数据与文献[16]对照一致，故鉴定化合物8为3β-hydroxy-7α-ethoxy-24β-ethylcholest-5-ene。

化合物9 白色针状晶体，TLC紫外灯（254 nm）下无暗斑，喷硫酸-香草醛显色剂加热显紫色。与β-谷甾醇对照品多种溶剂系统TLC比对，其Rf均相同，因此鉴定化合物9为β-谷甾醇（β-sitosterol）。

4 细胞毒活性测试

用0.25%胰酶消化处于对数生长期的人肝癌细胞株HepG2，并用含10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞浓度至50 000个/mL，接种细胞悬液至96孔细胞培养板中，100 μL/孔，5% CO2，37 ℃培养24 h。将各化合物用DMSO配制为10 mmol·L-1浓度储备液，临用前用含10%胎牛血清进行系列稀释，以100 μL/孔加入细胞培养板中，使化合物在细胞培养液中的终浓度分别为0，0.1，1，10 μmol·L-1，继续培养72 h。培养结束后，倒去细胞培养板中的培养基，各孔加入无菌PBS配制的0.5 g·L-1的MTT溶液，100 μL/well，5% CO2，37 ℃孵育4 h。倒去MTT溶液，各孔加入150 μL的DMSO震荡5 min后，在570 nm下测定吸光度，同等实验条件下重复3次。计算化合物各浓度对细胞生长的抑制率。

化合物1对人肝癌细胞系HepG2具有明显的细胞毒活性，样品浓度为10 μmol·L-1时，其抑制率为52.2%。化合物2～4（在浓度为10 μmol·L-1时，其抑制率27.4%，27.7%，15.3%）没有明显的抑制作用。

5 讨论

因为在分离纯化中未使用甲酸，基本排除化合物7为人工产物的可能，加之有报道该化合物从植物中以天然产物形式分离得到[15]，确定7为天然产物。化合物8应该为β-谷甾醇在提取过程中与乙醇反应的人工产物，从结构上分析经由7-羟基谷甾醇7位羟基与乙醇成醚键而成[16]。

虽然生物碱是包括绿绒蒿属在内的罂粟科植物的特征性成分，但相关研究资料显示，生物碱在青藏高原地区罂粟科植物中的含量并不高，不及黄酮等多酚类成分[9，17-18]。这种差异与植物特殊的生长环境相关。地区日照时间长且紫外线强度大，有学者认为这种强紫外线诱导和促进了机体细胞苯丙氨酸氨基裂解酶和查尔酮合成酶活性的提高，这2种酶是黄酮类成分合成和代谢的关键限速酶，因此导致活性氧清除剂黄酮等多酚类化合物的大量产生，这种生理适应机制能使植物抵御强辐射造成的氧化损伤[19]。另有观点表明，植物体内产生大量的黄酮等多酚类成分，首要功能是过滤高强度的紫外线，而不是作为抗氧剂以清除体内的自由基，这是生物进化赋予植物的调节机制[20-21]。无论如何，都表明受强紫外线照射的高原植物，主要二次代谢产物是多酚类，而不是分类学上的特征性生物碱类成分。

然而，受地理环境、科技水平和民族文化等多方面的影响，目前我国藏药的物质基础研究仍很薄弱，包括绿绒蒿属藏药在内的大部分藏药研究还停留在初级阶段，严重限制其临床用药的有效性、安全性，和药用资源的利用率。因此，开展系统深入的藏药药效物质基础研究，是当下民族药研究的首要和重要内容之一。

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Chemical constituents from a Tibetan medicine Meconopsis horridula

GUO Zhi-qin1，2， GUO Qiang1，2， ZHU Zhi-xiang1， ZHANG Shui-ying1，2， LI Chun1，

CHAI Xing-yun1*， TU Peng-fei1*

（1.Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

2.School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] A phytochemical investigation on the aerial parts of a Tibetan medicine Meconopsis horridula，by solvent extraction，repeated chromatographies on silica gel，Sephadex LH-20，and preparative TLC techniques，led to the isolation of 9 compounds. By spectroscopic analysis and comparison of its 1H and 13C-NMR data with those in literatures，their structures were identified as oleracein E（1），N-（trans-p-coumaroyl）tyramine（2），chrysoeriol（3），apigenin（4），hydnocarpin（5），p-coumaric acid glucosyl ester（6），stigmast-5-ene-3β-ylformate（7），3β-hydroxy-7α-ethoxy-24β-ethylcholest-5-ene（8），and β-sitosterol（9），respectively，among which compounds 6-8 were isolated from the genus for the first time，and 1，3 were isolated from the species for the first time. A MTT method was applied to evaluate the cytotoxic activity of compounds 1-4 against the human hepatocellular liver carcinoma cell line（HepG2），and compound 1 showed significant cytotoxicity against HepG2，with its inhibitory rate of 52.2% at 10 μmol·L-1.

[Key words] Tibetan medicine； Meconopsis horridula； chemical constituents； cytotoxic activity

doi：10.4268/cjcmm20140702