砧木(葫芦)种子干热灭菌消毒处理研究

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摘 要： 以砧木（葫芦）种子为试验材料，对其进行干热处理，处理前后检测种子细菌性果腐病及黄瓜绿斑驳花叶病毒的带菌、带毒情况，同时检测干热处理对种子发芽势及发芽率的影响。结果表明：干热处理可以显著降低种子带菌、带毒量；同时干热处理对种子发芽率、发芽势的影响在种子水分恢复到4% 时即可恢复至96%。

关键词： 葫芦； 干热处理； 细菌性果腐病； 黄瓜绿斑驳花叶病毒； 发芽率； 发芽势

近年来，西瓜种植的产业化、规模化趋势愈加明显，随着生产规模的扩大，嫁接栽培逐渐成为广大农户的首选，但嫁接过程中出现的西瓜嫁接死苗、果实坏瓤等现象，逐渐成为困扰广大种植户的突出问题。研究表明，西瓜嫁接死苗、果实坏瓤等现象的产生与作为砧木的种子本身带有细菌性果腐病菌、黄瓜绿斑驳花叶病毒有密切关系。现有的种子消毒方法主要是热烫浸种、单一药剂处理等，在实际应用过程中容易出现消毒不彻底、影响砧木种子芽率等问题。2011—2012年，合肥丰乐种业股份有限公司、安徽省西瓜甜瓜工程技术研究中心对现在最新的种子处理手段——干热处理的灭菌消毒效果及其对种子发芽率、发芽势的影响进行了研究，干热处理可有效避免常规处理的不足之处，不仅可以杀死种子表面附着的病菌，还可以杀死潜伏在种子内部的病菌[1]，并钝化病毒，起到其他种子消毒方法所达不到的效果。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试种子：选取检测带有细菌性果腐病及黄瓜绿斑驳花叶病毒的砧木（葫芦）种子。

1.2 研究方法

1.2.1 供试种子处理 将西瓜细菌性果腐病标准菌株稀释成≥106 cfu·mL-1的菌悬液，用菌悬液浸泡供试种子1 h，然后放入鼓风干燥箱28 ℃ 烘干。

1.2.1 葫芦种子干热处理 供试种子按照每批次1 000粒的标准，分成3个批次，分别编号为H-1、H-2、H-3。供试种子先通过低温烘干将水分降低至2% 以下，72 ℃ 处理12 h。处理结束后将种子进行室内常规贮存，等种子水分恢复至4% 的时候再次检测发芽率、发芽势。每个批次处理种子 1次重复。

1.2.2 西瓜细菌性果腐病检测 供试种子在干热处理前后分别选取1% 的种子，使用蒸馏水浸泡24 h后，直接使用种子浸出液进行PCR检测和电泳分析[2]。以标准菌株做阳性对照，以非果腐病病原细菌的核酸作阴性对照，用双蒸水代替模板DNA作为空白对照，进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖电泳分析。

将种子浸出液在BFB-08，TWZ半选择性培养基所制备的平皿培养基上划线，每处理做3个皿，28 ℃ 恒温培养48 h，观察结果。

1.2.3 黄瓜绿斑驳花叶病毒检测 选取3 000粒供试种子（重点挑选畸形、不成熟的种子）分成每重复500粒的6次重复，其中3次重复直接播于灭菌土中，另外3次重复经过干热处理后再播于灭菌土中。待长出3～4片叶后，每株采集1片叶片（表现症状的植株采集染病叶片），按照试验重复将采集的叶片混合后提取总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增[3]。以标准病毒做阳性对照，非标准植物病毒做阴性对照，用双蒸水代替模板DNA作空白对照，进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖电泳分析。

2 结果与分析

2.1 干热处理前后种子带菌、带毒检测结果

种子细菌性果腐病及黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测分别参考《SN/T 1465-2004 西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法》[2]中的常规PCR、半选择培养基检测方法和《SN/T 2344-2009 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法》[3]中的RT-PCR检测方法。试验结果表明：通过干热处理后，原先可以检测到带有细菌性果腐病及黄瓜绿斑驳花叶病毒的种子（H-1、H-2、H-3同批种子）均未再次检测到带菌、带毒，干热处理可以有效杀灭种子病菌、病毒。

图1是试样种子的细菌性果腐病常规PCR电泳图。由图中可以看到，原先带有细菌性果腐病病原的试样H-1、H-2、H-3经过干热处理已不带相关病原。同时观察半选择培养基也可以发现原先可以观察到大量菌落的试样干热处理后无法观察到相关菌落，仅有部分杂菌菌落存在，同时杂菌菌落数量也大幅下降。

图2是试样的RT-PCR扩增产物电泳图。图中可以明显观察到处理后无法检测到黄瓜绿斑驳花叶病毒扩增产物的存在，鉴于RT-PCR本身引物的特异性，在排除操作过程中植物组织总RNA提取失败的情况下可以判定试样种子处理后原带有的黄瓜绿斑驳花叶病毒已被钝化，在植株中不再发病。

2.2 干热处理对种子发芽势、发芽率的影响

从表1可以看出，通过干热处理，种子发芽率呈现明显下降的趋势，处理后随着种子水分的缓慢恢复，种子发芽势、发芽率也明显恢复，特别是当种子水分恢复至4%时，发芽势及发芽率就已恢复至处理前水平（大约96%）。

3 讨 论

通过合理的干热处理流程可以有效杀灭种子本身带有的细菌性果腐病病原，同时钝化黄瓜绿斑驳花叶病毒使其不再发病。细菌性果腐病和黄瓜绿斑驳花叶病毒病是现在严重危害西瓜生产的2种检疫性病害，其本身可由种子携带传播，并在嫁接操作中造成大面积扩散，从而对西瓜商品化生产造成巨大危害。干热处理在有效杀灭或钝化病原的同时又不会显著降低种子的发芽能力，因此可以说是种子后期处理的一种有效途径，丰乐种业已在部分产品上开始应用干热处理灭菌消毒技术。

在试验过程中，笔者发现种子处理效果的保持易受使用环境的影响。细菌性病原主要通过接触传染，嫁接操作过程中，由于工具、环境等因素的影响导致嫁接苗带菌一直是长期困扰广大西瓜种植户的问题，如何通过整体过程控制最终达到“无菌种子——无菌嫁接苗——无菌种苗”是一项系统性的工作，对其还需要进一步研究，以寻找后续过程的全面有效的解决方案。

参考文献

[1] 李明，李佐，杜翠花. 干热处理对甜椒种携带真菌、细菌防效研究[J]. 山西农业大学学报，2000，20（1）： 119-121.

[2] 中华人民共和国质量监督检验检疫总局. SN/T 1465-2004 西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法[S]. 北京：中国标准出版社，2005.

[3] 中华人民共和国质量监督检验检疫总局. SN/T 2344-2009 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法[S]. 北京：中国标准出版社，2009.