苦木成分分析及质量评价初步研究

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[摘要]建立RP-HPLC同时测定苦木中4个生物碱与1个黄酮成分含量的方法，并进行多批次药材成分分析，为苦木质量评价提供依据。采用Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脱，流速1.0 mL・min-1，检测波长254 nm。4个生物碱苦木碱L，苦木碱B，苦木碱F，苦木碱D和黄酮高丽槐素的标准曲线及线性范围依次为Y=6 525.6X+37.25（0.009～1.780 μg ， r=0.996 8），Y=3 662.3X+41.55（0.005～0.920 μg， r=0.999 5），Y=3 763.1X+146.87（0.015～3.060 μg， r=0.999 0），Y=2 174.1X+21.52（0.003～0.620 μg， r=0.999 5）， Y=276.25X+7.65（0.010～1.960 μg ， r=0.998 9），平均加样回收率在98.02%～101.8%，RSD%在1.2%～2.8%，重复性及精密度良好。经过系统的方法学考察，该法简便，准确，可用于苦木药材的质量分析及控制。

[关键词]苦木；β-咔巴啉类生物碱；铁屎米-6-酮类生物碱；二氢异黄酮；RP-HPLC

苦木为我国南方地区常用中药，为苦木科苦树属植物Picrasma quassioides（D. Don） Benn.的干燥枝和叶，性寒，味苦，有清热解毒，祛湿的功效，用于风热感冒，咽喉肿痛，湿热泻痢，湿疹，疮疖，蛇虫咬伤[1]。化学成分研究表明，苦木中主要含有生物碱类，内酯类，黄酮类等化学成分[2-6]，其中生物碱类成分主要为铁屎米-6-酮型及β-咔巴啉型。《中国药典》2010年版（一部）收载苦木的质量标准为性状鉴别，显微鉴别及生物碱薄层色谱鉴别，无含量测定项。苦木及含苦木制剂的质量分析报道多为HPLC测定其中铁屎米酮型生物碱的含量 [7-10]，而对β-咔巴啉型生物碱及黄酮类成分的质量控制尚鲜见报道。为有效控制苦木质量提供可靠的方法，本研究建立RP-HPLC同时测定苦木中2类生物碱（β-咔巴啉型生物碱，包括苦木碱L，苦木碱B；铁屎米-6-酮型生物碱，包括苦木碱F，苦木碱D）及黄酮类（高丽槐素）含量，并进行多批次样品中上述成分含量测定，以期为苦木药材及其制剂的质量控制标准的再提高提供可资借鉴的基础研究资料。

1材料

大连依利特P230高效液相色谱仪，配置紫外检测器及EC2000色谱工作站（大连伊利特分析仪器有限公司）；AT-330色谱柱恒温箱（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；Sartorius 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。液相用乙腈为色谱纯（美国Honeywell），水为超纯水，其他试剂均为国产分析纯（汕头市光华化学厂有限公司）。

苦木碱L（1-hydroxymethyl-β-carboline，1），苦木碱B（1-methoxicabony-β-carboline，2），苦木碱 F（4-methoxy-5-hydroxy-canthin-6-one，3 ），苦木碱D（4，5-dimethoxy-canthin-6-one，4），高丽槐素（maackiain，5）均为自制，经光谱学鉴定结构，色谱法检测其纯度均为98%以上。

苦木测试样品共10批，经广州中医药大学药用植物学教研室潘超美教授鉴定为苦木科苦树属植物苦木P. quassioides的干燥枝和叶，凭证标本现保存于广州中医药大学临床药理研究所。

2方法与结果

2.1色谱条件及系统适应性 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～22 min，18%～25%A；22～30 min，25%～40% A；30～60 min，40%～45%A）；流速1.0 mL・min-1；检测波长254 nm。对照品和样品进样量均为15 μL，色谱图见图1。理论塔板数苦木碱 L和B不低于8 000，苦木碱 F 和苦木碱 D不低于1万，高丽槐素不低于5 000。

2.2对照品溶液的制备 精密称取对照品1～5各适量，用甲醇充分溶解并定容，即得混合对照品储备液，其中1～5的质量浓度分别为88.8，46.0，145.2，31.2，98.0 mg・L-1。

2.3苦木供试品溶液的制备 取干燥至恒重的苦木粉末约1.0 g，精密称定，加95%乙醇50 mL，超声提取2次，每次15 min，提取液过滤，滤液减压回收溶剂，残渣用甲醇溶解并定容至25 mL，摇匀，进样前过0.45 μm微孔滤膜。

2.4线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液0.1，1，5，10，15，20 μL，进样测定，以峰面积积分值（Y）对进样质量（X）进行线性回归，得回归方程，结果见表1。

2.5精密度试验 精密吸取混合对照品溶液连续进样5次，5个目标成分的峰面积RSD（n=5）在0.7%～1.2%，表明仪器精密度良好。

2.6稳定性试验 精密吸取苦木供试品溶液，分别于0，2，4，8，18，24 h依次进样，5个成分峰面积的RSD（n=8）在1.8%～2.8%，表明供试品在24 h内稳定。

2.7重复性试验 取同一批次样品6份，制备供试品溶液，测定5个化合物的含量，RSD（n=6） 在1.6%～2.3%，表明该方法重复性良好。

2.8加样回收率 称取已知含量的同一批样品分别加入5个对照品适量，制备供试品溶液，进样测定，见表2。

2.9样品测定 取10批次苦木样品，制备供试品溶液，进样测定，每批样品平行制备3份，每份进样3次，见表3。

3讨论

3.1色谱条件优选 比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%冰醋酸，乙腈-0.1%三氯乙酸，乙腈-0.1%磷酸等溶剂系统，以乙腈-0.1%磷酸溶液进行梯度洗脱时，各待测成分的分离度好。

3.2供试品溶液制备方法的优选 以从苦木中分离得到的4个生物碱及1个黄酮成分含量为指标，比较了不同提取方法（超声波萃取，热回流，索式提取法），不同提取溶媒种类（95%，80%，70%，50%乙醇），不同提取溶媒用量（10，20，30，50，60，80倍量），提取时间（15，30，40，60 min），提取次数（1，2，3次），确定了2.3所述供试品制备方法。

3.3苦木药材的质量评价 迄今为止，苦木药材质量评价尚缺乏有效的方法，2010年版《中国药典》苦木质量标准无专属成分含量测定及限度，有学者采用HPLC测定苦木中铁屎米-6-酮型生物碱的含量，但未见β-咔巴啉型及其他成分含量测定的报道。本文采用RP-HPLC同时测定10批苦木样品中4个生物碱及1个二氢异黄酮的含量，结果5个指标成分的含量范围分别为0.20～0.34 mg・g-1（1），0.26～0.45 mg・g-1（2），3.31～3.86 mg・g-1（3），0.18～0.52 mg・g-1（4）和2.64～3.98 mg・g-1（5）。 其中2个β-咔巴啉型生物碱的总量平均值为0.61 mg・g-1， 2个铁屎米-6-酮型生物碱的总量平均值为3.98 mg・g-1。不同产地及采收时间的样品含量差异较小，初步推断该药材质量较稳定，尚需大样本样品验证。

根据本实验样品测定结果建议苦木药材的质量控制标准中增加铁屎米-6-酮型生物碱即苦木碱F的含量测定并制定其含量限度；增加β-咔巴啉型生物碱及二氢异黄酮即高丽槐素的鉴别项。

[参考文献]

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Simultaneous determination of 4 alkaloids and a flavonoid in

Picrasmae Ramulus et Folium by RP-HPLC

WU Chong， DENG Gui-hua， LIN Chao-zhan*， ZHU Chen-chen*

（Institute of Clinical Pharmacology， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510405， China）

[Abstract] A RP-HPLC method was developed to evaluate the quality of Picrasmae Ramulus et Folium by simultaneous determination of five constituents including 1-hydroxymethyl-β-carboline（1）， 1-methoxicabony-β-carboline（2）， 4-methoxy-5-hydroxy-canthin-6-one（3）， 4， 5-dimethoxy-canthin-6-one（4） and maackiain（5） in Picrasmae Ramulus et Folium.The samples were separated on a Kromasil RP-C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm） column eluted with acetonitrile and 0.1% phosphoric acid as mobile phases in gradient mode. The detection wavelength was set at 254 nm.The calibration curves and linearity of the above five standards were determined as（1） Y=6 525.6X+37.25（0.009-1.780 μg， r=0.996 8），（2） Y=3 662.3X+41.55（0.005-0.920 μg， r=0.999 5），（3） Y=3 763.1X+146.87（0.015-3.060 μg， r=0.999 0）， （4） Y=2 174.1X+21.52（0.003-0.620 μg， r=0.999 5）， and（5） Y=276.25X+7.65（0.010-1.960 μg ，r=0.998 9）， respectively. The method is simple and repeatable， and can be used for the quality assessment of Picrasmae Ramulus et Folium.

[Key words] Picrasmae Ramulus et Folium； β-caboline； canthin-6-one； macckiain； RP-HPLC

doi：10.4268/cjcmm20140922