蛭龙活血通瘀胶囊对局灶性脑缺血大鼠脑组织TGF—β1表达的影响研究杨思进
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摘要：目的 探讨蛭龙活血通瘀胶囊对局灶性脑缺血大鼠脑缺血区TGF-β1表达的影响。方法 将120只健康雄性成年SD大鼠，体重（250～300）g，随机分为六组（另30只备用）：假手术组、模型组、蛭龙活血通瘀胶囊高剂量组、蛭龙活血通瘀胶囊中剂量组、蛭龙活血通瘀胶囊低剂量组、步长脑心通对照组，每组20只。以Zea longa法为标准制作大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型，假手术组只行正中切口，但不插入线栓。各用药组均在动物苏醒后灌胃，假手术组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，连续7 d（n=20）。术后7 d，心脏灌注固定，断头取脑，采用免疫组化方法检测大脑皮层缺血区TGF-β1的蛋白表达。结果 蛭龙活血通瘀胶囊治疗组大鼠脑组织缺血区tgf-β1表达较模型组明显升高。结论 蛭龙活血通瘀胶囊可能通过神经内分泌-免疫网络使缺血皮质神经元和胶质细胞TGF-β1表达显著增加，促进血管再生，修复损失脑组织，从而发挥脑保护作用。
关键词：蛭龙活血通瘀胶囊；脑缺血；转化生长因子-β1
转化生长因子（Transforming growth faetor-β1，TGF-β1）是一种普遍存在的细胞因子，其作用涉及细胞生长、分化、炎症和组织修复。近年来研究表明[1-2]，在缺血性脑损伤中TGF-β1有抗氧化、阻止细胞凋亡、调节炎症反应以及胶质细胞和星形细胞反应的多种作用。蛭龙活血通瘀胶囊系由黄芪、水蛭、地龙、大血藤等组成的复方制剂，具有益气活血化瘀通络，祛风的功效。我们观察发现蛭龙活血通瘀胶囊能明显促进局灶性脑缺血大鼠神经功能恢复，其机制可能与促进缺血脑组织TGF-β1表达有关。
1资料与方法
1.1一般资料
1.1.1动物 健康雄性成年SD大鼠150只，体重250～300 g，皮肤光滑润泽，呼吸道通畅，清洁级，由泸州医学院动物实验中心提供。
1.1.2试剂与药物 TGF-β1单克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司，批号：G57121。磷酸盐缓冲液（PBS）， 北京四正柏生物科技有限公司。DAB显色试剂盒，北京四正柏生物科技有限公司。蛭龙活血通瘀胶囊：由泸州医学院附属中医院制剂室提供。批号：20121212；步长脑心通胶囊：咸阳步长制药有限公司产品，批号：1209955。
1.2方法
1.2.1造模方法及动物分组 参照Zea longa等[3-5]报道的线栓改良法造模，造模动物在自然苏醒后，参照Zealonga评分[3]标准进行5分制评分，评分标准：无神经损伤症状，0分；不能完全伸展对侧前爪，1分；向外侧转圈，2分；行走时向对侧倾倒，3分；不能自发行走，意识昏迷，4分。将术后24 h评分为1～3分的大鼠选入组，其余动物剔除，并作随机补充。用随机数字表法分为6组，即蛭龙活血通瘀胶囊高剂量组、蛭龙活血通瘀胶囊中剂量组、蛭龙活血通瘀胶囊低剂量组、步长脑心通胶囊对照组、脑缺血模型组和假手术组。
1.2.2药物干预 蛭龙活血通瘀胶囊成人的临床用药量为4.8 g/d。按人体用量的5、10、20倍，成人体重按60 Kg计算，换算为动物低、中、高剂量组的用药量，分别为0.4 g/Kg/d、0.8 g/Kg/d、1.6 g/Kg/d；对照组按成人用量的10倍给药，即0.8 g/Kg/d。各药物干预组大鼠均给予等体积（3 mL）相应浓度的药物灌胃，假手术组及模型组大鼠给予等体积（3 mL）的生理盐水灌胃，1次/d，连续7 d，并按体重调整给药量。
1.2.3指标采集及检测方法
1.2.3.1免疫组化标本制备及检测 脑缺血7 d后，各组大鼠均腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/Kg）腹腔麻醉后，颈动脉放血后，打开胸腔，暴露心脏，将灌注插管从心尖（左心室）部位插入直至左心室升主动脉，同时剪开右心耳，先灌注20℃的0.9%生理盐水200 mL，然后灌注4℃的4%多聚甲醛200 mL，灌注后，大鼠肺部、肝脏、以及全身肌肉变得僵硬，为灌注成功。迅速断头，剥取脑组织，去除嗅球和小脑，在视交叉前后2 mm处冠状切取脑组织，置于4℃的4%多聚甲醛固定48 h后，进行常规脱水石蜡包埋，连续切片，片厚约5 μm，每隔5张取1张，SP法Ang-1、Tie-2免疫组化染色，DAB显色。任何被TGF-β1抗体染成棕黄色或棕褐色细胞均可视为阳性表达。
1.2.3.2计算机图像分析 将切片于光镜下放大400倍，采用Image-Pro-Plus 6.0图像分析软件进行图像分析，每例大鼠随机选取3张切片，每张切片随机选择3个不同视野，计数视野内阳性细胞数（被染成棕黄色或棕褐色为阳性细胞），每组所有照片的平均阳性细胞数代表该组的阳性细胞数。
1.2.3.3统计学方法 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，使用SPSS11.5软件进行统计学处理，组间差异采用方差分析（One Way Aonva），两两对比采用t检验。P
2结果
各组大鼠脑组织TGF-β1阳性表达 TGF-β1在假手术组大鼠脑组织极少量阳性表达。模型组大鼠脑缺血区吞噬细胞阳性表达较假手术组增强，差异有统计学意义（P
3讨论
TGF-β1是一种有效的免疫调节剂，它可以参与炎症反应和组织修复，对细胞的生长、分化和免疫功能都具有重要的调节作用。TGF-β1在正常脑组织中的表达水平不高，一般只在大脑皮质、脑膜、脉络丛处可检测到，但在病理条件下则明显升高[6]。
本实验发现，与模型组比较，蛭龙高剂量组、中剂量组及步长对照组大鼠脑组织TGF-β1表达明显升高（P0.05）。而TGF-β1在脑缺血后TGF-β1表达增加可通过以下途径发挥脑保护作用：①促进血管生成：TGF-β1可以激活缺血半暗带的血管内皮细胞，促进微血管的增长，促进缺血区侧支循环的建立；②发挥神经保护作用：TGF-β1能降低Ca2+的浓度，维持Ca2+的体内平衡，刺激bcl-2的产生，上调脑源性神经营养因子的产生，导致TGF-β1在神经元内自身合成，同时TGF-β1可延长神经元的存活，抑制星形胶质分化，刺激星形胶质细胞释放蛋白酶抑制剂；③抑制中性粒细胞的粘附：TGF-β1对致炎性细胞因子TNF-α具有明显拮抗作用，并同时减少粘附受体表达来降低中性粒细胞与内皮细胞间的粘附，具有免疫下调作用；④降低其他细胞因子如TNF-α、IL-1β的表达；⑤加强对损伤脑组织的修复：TGF-β1刺激细胞外基质（ECM）的产生，抑制蛋白酶和基质酶的活性，从而促使ECM沉积， ECM的积聚对损伤后组织的修复有利。蛭龙活血通瘀胶囊治疗组TGF-β1表达较模型组明显增加，说明蛭龙活血通瘀胶囊可能通过神经内分泌-免疫网络使缺血皮质神经元和胶质细胞TGF-β1表达显著增加，促进血管再生，从而发挥脑保护作用。
参考文献：
[1]Longa EZ， Weinstin PR， Carlson S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J].Stroke，1989，20（1）：84-91.
[2]黄斌，王兴勇，匡凤梧，等.线栓法制备Wistar大鼠局灶性脑缺血模型的实验研究[J].现代医药卫生，2005，21（15）：1935-1937.
[3]刘运泉，戴颖.线栓法大鼠局灶性脑缺血模型的改进[J].中国临床解剖学杂志，2005，23（2）：222-223.
[4]Krupinski J， Kumar P， Kumar S， et al. Increased expression of TGF-β1 in brain tissue after ischemic stroke in human. Stroke，1996，27（5）：852.
[5]Gamble JR， Khew-Goodall Y， Vadas MA， et al. Transforming growth factor beta-1 inhibits E-select in expression on human endothelial cells.J Immunol，1993，150（10）：4493.
[6]钱忠信，李巍，包晓群，等.转化生长因子与脑缺血[J].中风与神经疾病杂志，1999，16（4）：254.