川牛膝的HPLC指纹图谱研究

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摘 要：目的：采用HPLC法构建川牛膝药材的化学指纹图谱。方法：采用Waters 2695 高效液相色谱仪，色谱柱为Symmetry®C18(5μm，4.6×250mm，Waters公司)；流动相为甲醇-水二元梯度洗脱；流速为0.9ml/min；柱温为35℃；检测波长为266nm。结果：测定基地产及市场上流通的样品共18批次，标示了11个共有峰，其指纹图谱相似度均在0.9以上，指纹图谱整体面貌基本一致。结论：该方法简便、快速、准确、重现性好，为川牛膝药材的定性鉴别和药材内在质量评价提供了依据。

关键词：川牛膝；指纹图谱；hplc

中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)04-027-03

川牛膝为苋科杯苋属植物川牛膝(Cyathula officinalis Kuan)的干燥根，是著名的川产道地药材之一，具有逐瘀痛经，通利关节，利尿通淋的功效[1]。川牛膝始见唐代蔺道人的《仙授理伤续断秘方》。在功效上，目前全国的一些权威著作一致认为“怀牛膝和川牛膝的功效基本相同，但是前者偏于补肾强筋骨，而后者偏于活血化瘀” [2]。现在药理学研究表明，川牛膝不仅能活血化瘀，还有很好的调节免疫系统功能的作用。

目前国内对川牛膝的研究主要集中在其化学成分及药理研究方面，缺乏综合评价药材品质的方法和标准，且川牛膝在长期的应用和栽培的过程中，种内产生很大的变异，出现伦理较多的类型，同时由于加工、储存等方法的不同，药材质量存在较大的差异，造成目前药材质量不稳定和市场药材质量无法评价的局面。本研究通过采用HPLC法建立川牛膝药材指纹图谱，为控制川牛膝药材的综合质量提供参考依据。

1 试验材料、试药、试剂与仪器

1.1 试验材料、试药、试剂

川牛膝药材：经成都中医药大学峨眉学院王书林教授鉴定为苋科植物川牛膝(Cyathula officinalis Kuan.)的干燥根，符合2005年版《中国药典》规定，见表1。

对照品：杯苋甾酮(cyasterone)由四川省中医药研究所提供。试剂：甲醇(色谱纯)，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Waters2996-2695型高效液相色谱仪；Waters Empower化学工作站；KQ3200型超声波清洗器(40KHZ，120W)，昆山市超声仪器公司；BP-211D型电子分析天平(Max：210g，d=0.1mg)，北京赛多利仪器系统有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Symmetry®C18(5μm，4.6×250mm，Waters公司)；流动相：甲醇-水二元梯度洗脱，如表2；流速：0.9ml/min；柱温：35℃；检测波长：266nm；进样量：20μl；运行时间：35min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

取杯苋甾酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60μg溶液，即得。

2.2.2 样品溶液的制备

取川牛膝药材细粉(批号7#)5g(过四号筛)，精密称定，置于100ml锥形瓶中，精密量取甲醇50ml，振摇，回流提取1h，放冷，加甲醇补足损失的重量，摇匀，水浴挥干，残渣加甲醇使溶解，定容至10ml，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[3，4，5，6]。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

精密吸取对照品溶液20μl，重复进样5次，≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在1.3263%～2.1634%之间，表明精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取同一批次的川牛膝药材6份，按上述样品测定方法分别测定，≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在2.3013%～2.8706%之间，表明方法重现性良好。

2.3.3 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24h分别进样20μl，≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在2.1181%～2.5066%之间，表明样品在24h内稳定。

2.4 指纹图谱相似度分析

2.4.1 共有峰的标定

根据18批次供试品测定结果所给出的峰数，对峰值和峰位等相关参数进行分析、比较，川牛膝药材高效液相色谱可分离出20多个色谱峰，经与杯苋甾酮对照品对照，并比较所有记录的色谱图，选取11个共有峰作为指纹图谱的特征峰，其中9号峰为杯苋甾酮。

图1 川牛膝HPLC指纹图谱

2.4.2 共有图谱模式的建立

根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，以参照物峰(S)的相对保留时间和相对峰面积为1，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。杯苋甾酮为川牛膝药材中的主要有效成分，且其峰面积在图谱中相对较大，保留时间适中，故选择杯苋甾酮为参考峰(S)，以其保留时间和峰面积为1，计算各样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.4.3 图谱相似度分析

根据18批样品的相对保留时间及指纹图谱的整体谱峰特点对峰进行匹配，以相对方面积的平均值建立共有模式，见图2，以相关系数法对样品的相似度进行评价，各样品相似度结果见表3，结果表明，大多数样品之间相似度良好，都达到0.90以上，平均相似度为0.906。

图2 18批川牛膝样品指纹图谱

3 讨论

本课题首次将HPLC法运用到川牛膝药材的鉴定与质量评价中，能更加有效地解决药材化学成分的多样性与复杂性的质量评价技术难题。本实验采用二极管阵列检测器对指纹图谱的检测进行了选择，结果表明在检测波长266nm处，色谱图所包含的信息量更大。从相似度分析结果来看，18批川牛膝药材相似度均在0.9以上，表现出良好的相似性。在川牛膝药材指纹图谱的共有特征峰中，整体分离度较好，能充分反映出川牛膝药材醇溶性物质的化学成分特征，可用于川牛膝药材鉴定及内在质量评价。在本实验建立的川牛膝药材指纹图谱分析方法中，杯苋甾酮的保留时间适中，与相邻色谱峰达基线分离，分离度良好。

本实验所建立的方法，精密度、稳定性和重复性均符合指纹图谱研究的技术要求，为进一步制订川牛膝质量评价标准提供了科学依据。

参考文献：

[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：人民卫生出版社，2005：26.

[2] 《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编(上册)[M].北京：人民卫生出版社，1996：217~229.

[3] 陈幸，黎万寿，朱久武.等.RP-HPLC法测定川牛膝中杯苋甾酮的含量[J].重庆中草药研究，1999，(40)：69~71.

[4] 马英，毕开顺，王玺等.HPLC法测定川牛膝中杯苋甾酮的含量[J].中草药，2000，31(6)：427~428.

[5] 黎万寿，陈幸，李彬.等.正交法优选酒炙川牛膝最佳炮制工艺[J].现代中药研究与实践，2005，19(4)：54~56.

[6] 黎万寿，陈幸，李彬.等.正交法优选盐炙川牛膝最佳炮制工艺[J].时珍国医国药，2005，16(12)：1205~1206.