绞股蓝总苷对免疫功能低下小鼠模型特异性免疫功能的影响
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摘要：目的：用鲮股蓝总苷作为免疫增强剂治疗免疫低下小鼠模型。观察特异性免疫功能的变化。探讨绞股蓝总苷免疫增强的药理作用，观察剂量效果关系。方法：小鼠随机分为6组，模型组皮下注射环磷酰胺，制造免疫低下模型，与各对照组和药物高、中、低剂量组分别作血清溶血素实验和小鼠迟发型变态反应，观察各组特异性免疫功能变化。结果：模型小鼠的体液免疫功能和细胞免疫功能明显下降，而阳性药和高、中剂量绞股蓝均可明显地增强该免疫功能，绞股蓝总苷的作用强度呈剂量依赖性，高剂量组的作用略强于阳性药。结论：以较低剂量环磷酰胺成功造成小鼠免疫低下模型。绞股蓝总苷能非常明显地增强特异性免疫功能，作用呈剂量依赖性。最高剂量推荐200－400=g／kg。
关键词：鲮股蓝总苷；溶血素；迟发型变态反应；NIH小鼠
中图分类号：P285.5
文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2008)01－0145－02
绞股蓝总皂苷(gypencides，GPs)是从葫芦科植物绞股蓝中提取的具有四环三萜达玛烷型结构的皂苷，到目前为止已分离出80多种皂苷成分，其中4种成分与人参皂苷Rbl、Rb3、Rd和F2在化学结构上完全相同。另外，尚有多种神经酸或酶水解后可能转化为人参皂苷Rg3、Rd和F2。据报道GPs有降血脂、抗衰老、调节机体免疫功能以及抗肿瘤等多种药理作用。本研究观察绞股蓝总甙片对免疫低下小鼠模型的特异性免疫功能的影响。
1 材料
1.1 药物绞股蓝总皂甙片(药物批号200401108)。陕西安康正大制药厂生产，皂苷含量97％，用生理盐水稀释成50mg／L浓度药液，给药剂量为：高剂量400rag／kg，中剂量200mg／lcg和低剂量50me／ks。甘露多聚糖肽片5rag／片(市购)，环磷酰胺粉针剂(本院药房领取)。
1.2 动物NIH小鼠，18－25g雄雌各半，广东省医学动物实验中心提供。豚鼠，雄雌不限，暨南大学实验动物中心提供。
1.3 试剂和器材阿氏液：葡萄糖2.05g，氯化钠0.42g，枸橼酸钠0.8g，蒸馏水加至1000mL，8磅10rain灭菌。都氏试剂：碳酸氢钠1.0g，高铁氰化钾0.2g，氰化钾0.05g，蒸馏水加至1000mL。补体：在3只豚鼠的新鲜血清中加入1／10压积SRBC，于4℃震荡30rain，2000r／rain离心10min。取上清液－20℃保存。鸡红细胞(CRBC)：无菌条件下割颈动脉取鸡血，置于有玻璃珠的三角烧瓶中轻摇10min去除纤维蛋白，加入2倍量阿氏液，置于4℃保存。临用前用生理盐水洗涤3次，2000r／rain离心10min得压积CRBC再按所需浓度稀释。(以上为体液免疫功能实验使用)
1％DNCB溶液：每次致敏或攻击前新鲜配制1％DNCB丙酮麻油溶液(丙酮：麻油为1：1)5mL，倒入小瓶内。盖好并用胶布封口，摇匀后。用250mL注射器通过瓶盖取用(细胞免疫功能实验使用)。
2 实验步骤
2.1 特异性体液免疫功能小鼠随机分组分成6组：正常对照组，模型组，阳性药物对照组，绞股蓝总苷高剂量组(400mg／kg)、中剂量组(200mg／kg)、低剂量组(50mg／kg)，每组10只。除前两组外，每组每日分别灌胃给药喂服绞股蓝总苷溶液一次，连续ll天。后5组动物均于第4天皮下注射环磷酰胺80mg／kg，制造免疫低下模型；并给所有小鼠静推5％CRBC生理盐水悬液0.2mL，按文献于第12天摘取眼球取血，分离血清，将血清用生理盐水稀释100倍。试管置冰浴中，依次加入稀释的血清lmL，5％CRBC0.5mL，10％补体ImL，37度恒温水浴保温31rain，移至冰浴中终止反应。另设不加CRBC生理盐水的空白对照(调零)组。1500r／rain离心5min，取上清lmL加蒸馏水3mL，摇匀放置10min，540hm下比色读取吸光度。另取5％CRBC 0.25加入蒸馏水至4mL，比色读取吸光度，作为CRBC半数溶血吸光度值。计算公式：HCS0＝OD／CRBC半数溶血OD×稀释倍数。
2.2 特异性细胞免疫功能小鼠随机分组分成6组：正常对照组，模型组，阳性药物(多抗甲素5mL)对照组，绞股蓝总苷高剂量组(400mg／kg)，中剂量组(200mg／kg)，低剂量组(50rag／lcg)，每组10只。除前两组外，每组每日分别灌胃给药喂服绞股蓝总苷溶液一次，连续9天。后5组动物均于第5天皮下注射环磷酰胺80mg／kg制造免疫低下模型，同时给所有小鼠腹部去毛。范围有3cm*3cm大小，并将DNCB溶液50ul均匀涂抹于上致敏，于次日再强化1次。致敏后第4天，将1％DNCB溶液10ul工均匀涂于小鼠右耳(两面)进行攻击，攻击后24h，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器于左右耳相同部位取下直径8mm的耳片，称重。于左右耳片重量之差为肿胀度，观察各组的差异。
3 统计分析
数据以均值+标准差表示，组间比较采用组间t检验，以P
4 结果
见表1、表2。
表1结果提示模型小鼠的体液免疫功能有明显降低，而阳性对照组和高、中、低剂量绞股蓝可非常明显地增强该项免疫功能，绞股蓝的作用强度呈剂量依赖性，高剂量组的作用略强于阳性组药。
表2结果显示模型小鼠的细胞免疫功能有明显下降，而阳性药和高、中剂量绞股蓝均有明显增强该项免疫功能，绞股蓝的作用强度呈剂量依赖性，高剂量组的作用略强于阳性药组。
5 讨论
绞股蓝总皂苷药理作用的多功能性，已有许多研究文献报道证实。粱军等的研究中阐述了GPs最适抑瘤剂量的概念。钱新华等对绞股蓝多糖对免疫功能的影响研究中也发现绞股蓝多糖能显著增强Heps小鼠Nk细胞活性，且与剂量有一定关系，随剂量的增大NK细胞活性也逐渐提高。王斌的研究也提及GP浓度与其免疫增强作用相关，但当GP浓度升高的免疫增强作用反而减弱，此作用的减弱不是其毒性所致，而是由其他介质释放所致。这些结果均提示我们作药学研究，使用免疫增强药，必需选择一个最适剂量才能达到预防疾病的目的。因此，本实验在前人所作基础上总结经验，提出最高剂量400ms／kg，中剂量200rag／kg，低剂量S0mg／kg，并用于实验小鼠慢支炎和免疫低下模型的免疫增强作用的强度观察。实验结果非常理想：GP的免疫增强作用在一定浓度(50me,／L)时，剂量一效果关系呈正相关关系。高剂量组的作用强度最佳，疗效略高于阳性药物对照组。故笔者推荐最适剂量范畴为200―400mr,／kg，并计划在此结果基础上换算人体的最适剂量，GPs用于临床慢性支气管炎免疫低下病人的免疫增强的治疗，并进一步确定人体的最适用量。本实验是对GPs定性研究后的一项定量研究。