顶空气相色谱法检验血液中乙醇含量
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【摘 要】 本文采用顶空进样方法，通过改进色谱条件，改进数据处理方式，从而建立一个改进的血液中乙醇的检验方法，以获得更好的分离效果和线性关系，解决实际应用中存在的同一个样品无法重复进样，标样存储和取用的问题。
【关键词】 内标曲线法 顶空气相色谱 血液中乙醇 相对标准偏差
乙醇广泛存在于日常饮用的各种饮品中，可以说是涉及人数最多、应用范围最广、滥用程度最高的一种毒（药）物。长期过量饮酒或慢性酒精中毒可诱发或导致心脑血管疾病、消化系统疾病、精神障碍等多种疾病，甚至导致死亡。饮酒后人的中枢神经活动会变得迟钝，致使手足活动迟缓、生理机能减退、视力听力等感知能力降低，还会导致行为异常，从而发生意外甚至犯罪，比如车祸、吸入呕吐物窒息而死、酒后肇事等[1]。酒后驾驶更是一直以来困扰我们的世界性的社会问题，是造成交通肇事的主要原因[2]。血液中乙醇含量（blood alcohol concentration，BAC）的检验在判定饮酒后驾车、饮酒后违法犯罪、饮酒中毒死亡等案事件中起到十分重要的作用。
现阶段对于血中乙醇含量的检测方法主要有化学法、光谱法、电池法、酶学法和气相色谱法[3，4]。其中顶空气相色谱法（HS/GC）具有分离效率高、检测灵敏度高、分析速度快、准确度较高、精密度高、杂质干扰少等诸多优点[5、6]，因而在BAC的测定中得到广泛应用。但是在实际应用中我们发现，实验过程往往受到同一个样品无法重复进样的问题，标样的储存和取用问题的困扰。因此，本文着重从上述三个问题入手，力争可以解决实际操作过程中遇到的这些问题。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
药品试剂：无水乙醇（Sigma-aldrich，色谱纯），叔丁醇（Fluka，色谱纯）。
仪器设备：顶空进样器（Agilent 7894E Headspace Sampler）；气相色谱仪（Agilent 6890N GC），GILSON活塞排代式移液器（M1000型），GILSON空气排代式移液器（P100型）。
1.2 实验步骤
（1）样品处理：将无水乙醇标准品配制成10mg/mL的标注样品贮备液，冷藏备用。
配制2.0mg/mL的叔丁醇溶液，作为内标物，冷藏备用。
精密量取血液样品500μL，加入10mL顶空瓶，再加入2.0mg/mL的叔丁醇内标液50μL，压盖封口，制成待检样品，供HS/GC分析。
（2）进样器条件：样品瓶温度70℃，进样环温度80℃，传输线温度90℃；
（3）色谱条件：色谱柱DB-ALC1 30m×530μm×3.0μm毛细管柱，柱温箱100℃（保持8min），载气N2，流速3.0mL/min；
（4）检测器条件：火焰光度检测器（FID），加热器温度280℃，氢气流量40.0mL/min，空气流量300mL/min。
（5）线性回归方程：将10mg/mL的乙醇标准贮备液分别稀释成20mg/100mL、40mg/100mL、80mg/100mL、120mg/100mL、200 mg/100mL、300mg/100mL、400mg/100mL等浓度梯度的标准溶液。每个浓度梯度平行5份，加入内标物溶液，制成样品进行HS/GC分析。分析所得数据，按照经叔丁醇校正过的乙醇峰面积建立校正表，将校正表保存到色谱方法中，即得内标曲线-顶空气相色谱法[7]。
2 实际应用中存在的问题
2.1 重复进样的问题
在实际应用中，时常会发生由于各种原因而造成检验血液量采集不足的情况。通过顶空气相色谱分析的原理[8]可知，顶空瓶内的样品每进样一次都会造成浓度的损失，所以不能像直接进样分析那样对同一个检材样品进行重复进样分析。而按照要求却需要平行取样和留样备检，如果检材的量不足会给检验工作带来很大的困难。
由此我们考虑到：由于每次的进样量很少，损失量不多，因此按照亨利定律计算，重复进样分析得到的结果偏差可能不是很大。如果推测成立，则我们虽然不能把通过重复进样获得的数据作为检验意见的依据，却至少可以在平行样品出现数据异常时，对其相对标准偏差（RSD）[9]进行分析，分辨误差是来自检材均匀性、检材处理还是仪器进样，在检材极少时进行这样的操作就很有实际意义。
2.2 标样存储的问题
进口的标准物质购买困难，且价格昂贵。为了保证检验的准确性我们又需要定期校准标准曲线，不断消耗标准溶液。所以，如果储存在3℃条件下的10mg/mL乙醇标准溶液储备液，能够长时间储存而不发生浓度的变化，就可以缓解标液消耗的难题，也为标准物质存储相关的研究提供一些借鉴。
2.3 标样取用的问题
不同温度下溶液的密度是不同的，那么3℃条件下冷藏备用的叔丁醇内标液或乙醇标准溶液是直接取出使用，还是放置达到室温（通常是20℃左右）后再使用就成为本文研究的内容之一。
3 结果与讨论
3.1 分离效果和线性关系
从图1可知，本文建立的方法因为采用顶空进样杂质干扰少，基线平稳；不改变柱温箱温度即能将乙醇峰和叔丁醇内标峰很好的分离且峰形良好。恒定温度还有利于仪器保持平衡，节约分析时间。
由本文方法求得的线性回归方程如下：
乙醇峰面积比=0.37184274AmtRatio+0.0136236（R=0.99969）
从图2可以看出，本文方法的线性关系良好，既说明了方法的可用性也说明了采用标准曲线法的准确性。
3.2 单次进样与重复进样对比分析
我们对低浓度和中等浓度两个梯度使用同一个样品重复进样3次，与3份平行样品单次进样所得数据均列于表1。从表1中的各组RSD值可以看出，同一个样品重复进样3次所产生的误差与3份平行样品单次进样之间的误差并没有明显差异，测得的乙醇含量也没有明显差别。充分证明重复进样的操作可以作为一个有用的辅助手段。
3.3 3℃封存1年的标准液与新配制标准液对比分析
取用一定量用封口膜封存在3℃下1年期的10mg/mL乙醇标准溶液储备液，分别稀释为20mg/100mL、200mg/100mL两个级别的标准溶液，与新配制的同等浓度的标准溶液进行对比实验，实验数据详见表2。通过对比各组数据可以看出，储存1年的10mg/mL的乙醇标准溶液储备液与新配制的溶液相比没有明显的差异，含量没有损失，数据的稳定性也好，可以继续使用。
3.4 冷藏标准液与常温标准液对比分析
我们分别用冷藏标液直接制样和放置至室温后制样的方式，对各自浓度为20mg/100mL、200mg/100mL的两组样品进行分析，评价其相对标准偏差（RSD），所得数值详见表3。通过对比各组数据可以看出，冷藏状态的标准溶液和常温下的相比，不论各物质的峰面积、最终的含量还是各自的RSD值都没有明显的差异，也没有明显的变化规律，说明溶液浓度没有发生明显变化，因此在日常的检验工作中可以将冷藏着的标准溶液取出后直接使用。
4 结语
本文使用顶空气相色谱法（HS/GC），结合工作曲线法和内标法，既能反应方法的灵敏度和线性相关情况，又能校正仪器、环境等因素造成的误差，从而改进了内标曲线-顶空气相色谱分析血液中乙醇含量的方法。此方法不仅能提高定量分析的准确性，还适用于大批量样品的分析，提高工作效率。运用这一方法对文中提到的几个问题进行了验证，得到理想的结果。
参考文献：
[1]白璐，廖林川等.乙醇相关问题的综合探讨[J].刑事技术，2004，2：25-27.
[2]David P. Phillips & Kimberly M.Brewer.The relationship between serious injury and blood alcohol concentration （BAC） in fatal motor vehicle accidents：BAC=0.01% is associated with significantly more dangerous accidents than BAC = 0.00%[J]. Addiction，2011，106：1614-1622.
[3]李琼，谢国明等.血乙醇浓度分析方法及其评价[J].分析仪器，2005，3：57-59.
[4]赵楚，桑向玲，付文辉.乙腈提取法测定血中乙醇含量[J].广东公安科技，2001，3（63）：22-23.
[5]潘静.顶空气相色谱法测定全血中乙醇的含量[J].医学临床研究，2008，25（6）：1088-1089.
[6]刘兆，杨瑞琴等.腐败血液中乙醇的顶空气相色谱分析[J].中国司法鉴定，2010，4：26-28.
[7]贺东霞.内标曲线法测定血中乙醇含量的优势[J].2010，9（2）：142-146.
[8]王永华.顶空气相色谱分析原理与技术[J].中国环境监测，2006，22（2）：7-13.
[9]王威，倪春芳等.顶空气相色谱内标法测定人血中乙醇含量的不确定度评定[J].刑事技术，2009，3：24-27.