牛奶抗生素残留检测方法研究进展
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摘要 近年来，不断出现的食品安全问题引起了人们的重视，凸显了食品安全方面存在的一些漏洞。牛奶作为一种营养丰富、价格低廉的食品，其安全问题几乎牵涉到每一个人，而抗生素残留问题是牛奶安全问题中比较严重的一个。如何快速准确地检测牛奶中是否存在抗生素残留很重要。主要综述了检测牛奶中抗生素残留的不同方法及各自的特点。
关键词 牛奶；抗生素残留；检测方法
中图分类号 R155.5 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）05-0300-03
近年来，出现的一系列牛奶安全问题，严重打击了消费者对奶制品的信心。牛奶中抗生素残留则是奶制品安全问题中较为突出的一个，已成为公众关注的焦点[1]。世界粮农组织（FAO）、世界卫生组织（WHO）的食品法、欧盟（EU）和美国食品与药品管理局（FDO）等对牛奶中抗生素残留量都有明确严格的规定，严禁抗生素残留量超标的牛奶上市[2]。在奶牛饲养中，如果不遵守规定的休药期、不合理用药、使用违禁药物等会导致牛奶中抗生素残留超标[3]。乳中抗生素残留主要存在2个方面的潜在危害：一是干扰人体正常菌群，引起细菌耐药性，导致部分人产生过敏反应；二是原料乳中的抗生素残留势必会对乳制品加工生产产生干扰，造成原料乳的浪费，致使企业效益蒙受损失[4]。目前监测牛奶中抗生素残留的方法主要有4大类[5]：即微生物检测法、酶联免疫法、理化检测法和免疫传感器法。每种方法依据的原理不同，适用范围、操作要求、灵敏度也不尽相同。本文综述了4类主要的检测方法，分析了它们的优点及局限性。
1 检测方法
1.1 微生物检测法
微生物检测法是较为广泛应用的最经典方法，测定原理是根据抗生素对微生物生理机能、代谢的抑制作用来定性确定样品中抗微生物药物残留[6]。其优点是操作简单、可靠、费用低、无需高级实验设备，一般实验室及养殖场都能使用。因为牵涉到微生物的培养，所以检测时间相对较长，不能实现定量检测，不能满足某些抗生素最低限的检测。微生物检测法主要包括纸片法、TTC 法、管蝶法、试剂盒法等[7]。
试剂盒为抗生素残留的检测提供了更为便捷高效的手段。试剂盒一般是一种微孔板，每个微孔中包含营养琼脂培养基、对抗生素敏感的菌株、pH值指示剂。其原理为：微孔板在65 ℃温浴时，孢子受热萌发生长繁殖产酸，使培养基的pH值降低，培养基的颜色由紫色变为草绿色或黄色。如果牛奶中含有高于检测线的抗生素，微生物孢子萌发受到抑制，则不产酸，培养基保持原来的颜色。用肉眼观察颜色变化即可判断抗生素残留情况[8]。
对该类常用的试剂盒的研究报道较多，Comunian et al[9]对delvotest accelerator试剂盒进行评估，低于欧盟最大残留量浓度的青霉素G和磺胺嘧啶很容易检测出来，假阳性率低至95%，但对四环素和庆大霉素的检测能力则较弱。检测有时会出现假阳性的结果，这与牛乳本身成分复杂及外部环境影响有关。牛乳pH值、牛乳是否热处理、乳中大肠杆菌量、成品乳中防腐剂杀菌剂以及检测者经验等都会不同程度地使检测结果呈假阳性。Chung et al[10]用微生物方法和HPLC检测牛奶中磺胺类抗生素残留量试验，在269份奶样中21份为阳性，而HPLC方法仅出现4份阳性。微生物检测法阳性率偏高，往往要配合其他方法一起对牛奶进行评估。它虽然具有一定的局限性，但因其方便快捷、不需要大型仪器和专业操作人员即可完成，为广大奶农所接受。
1.2 酶联免疫法
酶联免疫法（Elisa）的特点在于敏感性高、特异性强、重复性好、处理量大。因其操作简便、结果判断较客观等因素，已广泛应用于免疫学检验的各领域中。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，主要以竞争ELISA为主。
国外学者用合成的强力霉素半抗原，有对-氨基苯甲酸（PABA）臂，通过重氮偶合反应和混合酸酐的方法连接到牛血清白蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。酶联免疫吸附试验（ELISA）中，DOX-PABA-OVA偶联物作为包被抗原，而DOX-PABA-BSA用作免疫原，以产生多克隆抗体。优化主要参数后，得出检测限为1.96 μg/kg。交叉反应（CR）较弱，与其他抗生素的交叉反应均低于0.1%[11]。
国占宝等[12]采用杂交瘤技术，制备抗四环素单克隆抗体。检测灵敏度较高，检测限较低；平均批内和批间变异系数均小于15%；四环素与金霉素等同类抗生素的交叉反应率大于 60%，与其他类抗生素无交叉反应。
张慧丽等[13]根据恩诺沙星与标记有碱性磷酸酶的恩诺沙星同时与限量的特异性固相恩诺沙星抗体进行竞争结合反应，通过分离未结合的标记抗原，测定标记抗原与抗体复合物化学发光强度，经相应的数学函数计算出待测抗原的含量的原理，利用金刚烷类体系作为化学发光底物，快速地测定牛奶中恩诺沙星残留量。检出限可达239.9 pg/mL，检测范围为350～1 000 pg/mL，批内与批间相对标准偏差均小于15%。
Wang S et al [14]首先建立提取新霉素简便有效的方法，回收率为75%～105%，再用Elisa法来检测新霉素残留量。高效液相色谱法验证Elisa法的有效性，结果显示了良好的相关性，R2大于0.9。
用于检测牛奶中抗生素残留的酶联免疫法利用抗原抗体的特异性反应，故灵敏度较高[15]。但是一种方法只能检测一种或一大类抗生素，检测范围较小。酶联免疫法的关键在于制备特异性强且高效的抗体，重点在于半抗原的设计与合成、与载体蛋白的连接、抗体的制备，费用一般较高。
1.3 理化检测法
理化检测法是依据抗生素分子具有的性质，借助实验仪器对其分离检测的一种方法。分离应用的实验技术包括色谱和电泳等，检测应用的实验技术包括紫外、荧光、质谱、化学发光等。由于分离效率高、检测灵敏、结果稳定、重复性好、精确可靠，理化检测法是一种检测抗生素残留的精确方法。
Tang Q et al [16]用高效液相色谱法与串联质谱联用来同时测定牛奶中诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、芦氟沙星5种氟喹诺酮类药物残留。可以检测诺氟沙星含量为0.5 ng/g的牛奶，远低于国内规定的100 ng/g的最大残留限量（MRL）。
张 尹等[17]采用乙腈沉淀蛋白，磷酸盐缓冲溶液为提取液，采用超声辅助萃取，固相萃取小柱净化，通过高效液相色谱进行分析检测，完全适用于牛奶中 9种β-内酰胺类抗生素残留量检测。利用超声辅助萃取，增强溶剂的穿透力，加速目标成分进入溶剂，促进萃取的进行，极大地提高了抗生素的萃取率[18]。
田春秋等[19]利用高效毛细管电泳（HPCE）同时检测牛奶中青霉素类抗生素中间体6-氨基青霉烷酸（6-APA）以及3种青霉素类药物的方法。在采用40 mmoL/L磷酸二氢钾、20 mmoL/L硼酸缓冲体系（pH值7.8）、分离电压为28 kV、分离温度为30 ℃的电泳条件下，4.5 min 内可以实现对4种青霉素类药物的快速分离检测。Wang L et al[20]利用微流控芯片电泳激光诱导荧光检测牛奶样品中磺胺类药物残留量，体系中磺胺类药物用含5 mmoL/L硼酸和1%（W/V）聚乙烯醇的缓冲液提取。pH值、聚乙烯醇含量、硼酸浓度对磺胺类药物的分离有很大影响。检测限达到0.2～2.3 μg/L。
理化性质检测法要借助实验室的精密仪器，对样品要进行一定的处理后才能测定，虽具有很高的精确性，但前处理技术大都操作时间长，有机溶剂使用量大，对人体和环境安全同样存在着一定危险。
1.4 免疫传感器法
20世纪90年代以来，以生物传感器为基础的各种生物检测技术蓬勃兴起，不少技术也应用于牛奶中抗生素残留的检测领域，其中应用最为广泛的就是基于免疫分析原理的生物传感器。用于牛奶抗生素残留检测的免疫传感器主要有光学免疫传感器、磁性微球免疫传感器、电化学免疫传感器等类型。
1.4.1 光学免疫传感器。光学免疫传感器研究最多的是表面等离子体共振（SPR）传感器，它主要包括光波导器件、金属薄膜、生物敏感膜3个部分。SPR 技术是针对免疫传感器检测牛奶中抗生素残留报道最多的一种。Fernandez et al[21]介绍了自主研发的一种价格低廉的便携式表面等离子体共振（SPR）传感器。SPReeta评估套件SPR3，已用于开发检测分析牛奶中残留的喹诺酮类抗生素（FQS）的生物传感器[22]。王彩云等[23]研究了利用近红外透射技术和偏最小二乘法（PLS）快速测定牛奶中氯霉素残留含量，氯霉素残留的预测值与真实值的相关系数达0.989 3，预示集的平均回收率为99.77%。该方法可快速测定牛奶中氯霉素残留含量。
1.4.2 磁性微球免疫传感器。磁性微球免疫传感器是免疫学与磁性微球技术及传感技术相结合的一种检测方法，实质上是将抗体（或抗原）固定于磁性微球（IMMS）表面，形成固相抗体/抗原的复合物，经外磁场作用后，复合物被滞留，磁性微球载抗原/抗体复合物与其他组分分离，从而提高了传感器的检测精度。但最终还要通过信号转换器，将抗原抗体的特异性结合反应转换为光、电等其他信号来进行检测 。
刘 爽等[24]把合成的卡那霉素和氯霉素全抗原包被在聚苯乙烯微球表面，构成捕获抗原。利用捕获抗原、单克隆抗体及检测物三者来构建间接竞争免疫检测体系，并用荧光标记的二抗作为荧光探针标记与捕获抗原结合的单克隆抗体，从而得到悬液芯片系统的检测物。悬液芯片系统的激光激发不同型号的微球，并可以使其呈现出不同的侧向散射荧光（side scatter，ssc）和前向散射荧光（forward scatter FSC）。因此，悬液芯片系统能够根据不同的荧光区分不同的微球，从而达到分辨不同检测物的目的。悬液芯片系统上的另外一套检测系统能够对每个微球表面荧光探针的荧光强度进行检测以实现定量分析，双检测系统同时工作实现了高通量检测的目的。
刘天龙等[25]利用碳二亚胺法将抗生素合成抗原与表面具有羧基的聚苯乙烯微球通过酰胺键偶联成捕获抗原。通过对头孢氨苄和莱克多巴胺合成抗原包被微球的条件进行优化得到包被100 μL的微球所需两者合成抗原的量分别是8.4 μg和87.73 μg；在牛奶中，对头孢氨苄和莱克多巴胺的检测限分别是20.59 ng/mL和23.51 ng/mg，标准添加回收率在70%～110%。
1.4.3 电化学免疫传感器法。电化学免疫传感器法是利用抗原抗体高度特异性结合的性质，将免疫测试方法与生物传感技术联合起来，既有免疫反应的高特异性又有电化学方法的高灵敏性，在医疗卫生、环境等领域得到广泛应用。
武 海等[26]利用共价键合法，将新亚甲蓝（NMB）与辣根过氧化酶（HRP）标记的青霉素多克隆抗体（Ab）修饰于玻碳电极表面，制成电流型免疫传感器，NMB 作为介体能有效地传递电子，传感器对 H2O2 具有很好的催化作用。用此传感器对牛奶中的青霉素进行检测，其线性范围为0.25～3.00 ng/mL（R=0.984），检出限为 0.298 ng/mL。Tsekenis et al [27]采用交流阻抗无标记免疫传感器检测牛奶中的环丙沙星含量，用电沉积法将聚苯胺沉积到丝网印刷电极上，用于固定环丙沙星抗体，带有抗体的电极接触到牛奶中的抗原物质，电极的阻抗感应值随着抗原浓度的增加而增加。
免疫传感器是将高灵敏的传感器技术与抗原、抗体特异性反应相结合的一种检测方法，易于实现抗生素残留检测仪器的便携化、微型化和自动化，应用于抗生素残留物的分析极具现实意义。
2 展望
鉴于牛奶安全问题几乎牵涉到每一个人，事关人类公共卫生安全，作为牛奶安全问题中比较突出的抗生素残留问题不容小觑。防控牛奶抗生素残留应从以下几点出发，首先在奶牛饲养过程中要严控抗生素使用种类、剂量和时期，增强奶农防范意识，由于奶农知道生产过程中抗生素使用的种类、剂量等，可以有针对性地采用检测方法，在源头管控有抗生素残留的奶制品进入市场；其次严防生产环节抗生素流入，生产加工企业要有强烈的社会责任感；在防控奶制品抗生素残留过程中，食品安全监督关口同样要严把商品准入市场关，严格食品质量报备制度[28]。
常用的微生物检测法操作简便、实用性好、检测抗生素种类较多，实验室及养殖场都能使用。应用较广的微生物检测试剂盒一般是具有知识产权的国外产品，单样检测费用较高。我国微生物资源丰富，筛选适宜菌株开发有自主产权的微生物检测试剂盒是科研工作者面临的一个任务。理化性质检测法是实验室对样品定性定量分析常用方法，由于昂贵分析仪器的使用及对操作人员实验技能的较高要求使得此方法不能得到广泛采用。酶联免疫法需要针对1类或1种抗生素制配相应的抗体，其灵敏度一般较高，使用比较简单，其检测量将更趋近精确化、灵敏化。免疫传感器易于实现抗生素残留检测仪器的自动化、智能化，以提高分析效率、降低成本。不同的方法，依据的原理不同，精确度、检测线、使用的范围等也相应的有所不同。实际应用时往往要结合不同的方法，优势互补，达到精确检测的目的。
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