藏红花提取液对慢性高眼压兔视网膜的影响

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[摘要] 目的 建立兔慢性高眼压模型，分析藏红花提取液对慢性高眼压兔眼视网膜的作用效果。 方法 选取120只新西兰家兔，随机分为对照组、高眼压模型组以及干预治疗组，每组40只共80眼。高眼压模型组以及干预治疗组家兔通过注射复方卡波姆溶液建立慢性高眼压模型，干预治疗组家兔每日静脉推注藏红花提取液。在建立模型后的7 d、14 d以及4周，各组分别处死10只动物，利用光镜观察视网膜形态学变化，并检测视网膜超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）以及视网膜神经节细胞（RGCs）水平，对结果进行统计学分析。 结果 高眼压模型组及干预治疗组视网膜均发生肿胀、萎缩，与高眼压模型组相比，干预治疗组损伤程度较轻；建立模型7d时，高眼压模型组及干预治疗组SOD值明显低于对照组，MDA含量显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），但干预治疗组指标变化幅度明显小于高眼压模型组（P < 0.05）；建立模型14 d时，高眼压模型组及干预治疗组SOD明显恢复，接近正常水平，MDA含量仍高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；干预治疗组RGCs数目为（287.62±23.54）个，与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05），高眼压模型组RGCs数目为（62.78±10.24）个，显著低于对照组及干预治疗组，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 藏红花提取液能够保护慢性高眼压兔眼视网膜功能，可作为青光眼的有效治疗药物。

[关键词] 藏红花；眼高压；视网膜；超氧化物歧化酶；丙二醛；视网膜神经节细胞

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）09（a）-0004-04

[Abstract] Objective To establish a rabbit model of chronic ocular hypertension， analyze saffron extract effects for retina of rabbits with chronic high intraocular pressure. Methods 120 New Zealand rabbits were randomly divided into control group， model group and high IOP intervention group， 40 cases （80 eyes） in each group. Ocular model group and intervention group were established rabbits chronic ocular hypertension model by injecting carbomer solution， rabbits in the intervention group were given daily intravenous injection of saffron extract. After model establishment for 7 d， 14 d and 4 week， each group were sacrificed 10 animals. Retinal morphological changes were observed by light microscope， then superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA）， retinal ganglion cells （RGCs） levels were detected. The results were analyzed. Results The retinal had swelling， shrinking in the intervention group and model group， compared with the model group， the degree of damage was less in the intervention group. After model establishment for 7 d， SOD levels in the model group and intervention group were significant lower than the control group， and MDA levels in the model group and intervention group were significant higher than the control group， with statistically significant difference （P < 0.05）， but the rangeability in the intervention group was less than the model group （P < 0.05）. After model establishment for 14 d， SOD levels in the model group and intervention group had recovered to normal level， but MDA levels still higher than the control group， with statistically significant difference （P < 0.05）. The number of RGCs in the intervention group was （287.62±23.54）， compared with the control group， the difference was not statistically significant （P > 0.05）. The number of RGCs in the model group was （62.78±10.24）， which was significantly lower than the intervention group and the control group， with statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion Saffron extract can protect retinal function of rabbits with chronic high intraocular pressure， can be used as an effective therapy for glaucoma.

[Key words] Saffron； Ocular hypertension； Retina； SOD； MDA； RGCs

青光眼作为临床常见眼病之一，主要特征为视神经萎缩和视野缺损，视神经节细胞调亡以及神经纤维病变是引发视神经功能损害的主要病理基础[1-2]。藏红花提取液是羟自由基与超氧自由基的强效清除剂，能够抗氧化反应[3]，改善线粒体功能，抑制视神经细胞凋亡[4]。本文着重分析藏红花提取液对慢性高眼压兔眼视网膜超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）以及视网膜神经节细胞（RGCs）水平影响，现将结果总结报道如下：

1 对象与方法

1.1 实验动物

健康成年清洁级新西兰家兔120只，体重2000～2500 g，雌雄兼用。实验前应用裂隙灯显微镜以及眼底镜检查双眼证实双眼眼压以及视网膜正常，未发现眼部疾病。采用抽签法随机分为对照组、高眼压模型组以及干预治疗组，每组各40只家兔。遵循中国科学技术委员会制订的《实验动物管理条例》进行实验操作。各组实验动物的体重、饲养方式、兔龄差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 主要试剂及仪器

复方卡波姆溶液（上海申兴制药厂生产的卡波姆-940+山西双鹤药业生产的地塞米松）；丁卡因滴眼液（辽宁中医药大学实验室）；氯霉素滴眼液（武汉天天明药业有限责任公司，批号：国药准字H34024067）；速眠新注射液（农牧大学军事兽医研究所）；藏红花（辽宁中医药大学附属医院药剂科）；SOD分析试剂盒（南京建成生物工程研究所）；MDA分析试剂盒（南京建成生物工程研究所）；立式压力蒸汽灭菌器、电子天平、低温高速离心机、流式细胞分析仪、分光光度计以及共聚焦显微镜等均由辽宁中医药大学实验室提供。

1.3 藏红花提取液制备

称取15 g藏红花，加蒸馏水煮沸后过滤2次，减压浓缩滤液，添加950 mL/L乙醇（浓缩滤液与乙醇比例为1∶3），沉淀24 h，再次过滤，滤液经减压蒸馏对乙醇进行回收后，稀释到100 mL装瓶，蒸汽灭菌后放置在冰箱中（-4℃）保存，实验时稀释成50 g/L。

1.4 模型制备

参照文献[5]进行慢性高眼压模型制备。高眼压模型组以及干预治疗组新西兰家兔耳缘静脉注射速眠新（剂量标准为每公斤0.1 mL），全身麻醉后应用5 g/L丁卡因滴眼液行双眼表面麻醉，用1 mL注射器在角膜缘穿刺形成小针孔，在小针孔对侧角膜缘穿刺，抽出0.2 mL房水，注入复方卡波姆溶液0.2 mL，制成慢性高眼压模型。实验期间眼压范围应为32～39 mm Hg[6]（1 mm Hg=0.133 kPa），并持续4周。对照眼仅采取前房穿刺。

1.5 用药方法

每日上午8∶00～9∶00干预治疗组固定新西兰白兔后耳缘静脉注射藏红花提取液，剂量为40 mg/kg；高眼压模型组和对照组给予生理盐水，每日1次。高眼压模型组和干预治疗组每日测量眼压，如果出现眼压低于32 mm Hg，则持续注入复方卡波姆溶液。1个月为1个疗程。

1.6 检测指标及方法

成功建模后7 d 、14 d及4周各组分别选取10只动物进行空气栓塞处死，处死动物后立即摘除双侧眼球，去除晶状体及玻璃体，剥取视网膜，观察视网膜的形态学改变，并检测SOD、MDA水平以及RGCs。

1.6.1 视网膜形态学观察 摘除大鼠眼球，应用4%中性甲醛溶液进行固定后，剪除角膜及晶状体，采用乙醇脱水以及二甲苯透明，石蜡包埋后采取矢状切片，常规苏木精-伊红染色，光镜下观察视网膜形态学变化。

1.6.2 SOD活性检测 应用黄嘌呤氧化酶法。视网膜组织匀浆经离心（3500 r/min）处理10 min，留取上清液检测SOD活性。测定管及对照管分别加入试剂或样品，充分混匀后放置在37℃水浴箱中作用40 min，加入显色剂后混匀，静置10 min倒入光径比色杯中，在波长550 nm处用蒸馏水调零，比色测定各样本A值，依据公式计算SOD活性。

1.6.3 MDA含量检测 应用TBA比色法。离心（3500 r/min）处理视网膜匀浆10 min，取上清液待测。标准管、标准空白管以及测定管中分别加入TBA或样品，旋涡混匀器混匀后，用保鲜膜扎紧试管口，刺一小孔，放置在水浴箱中（95℃）作用40 min后取出，流水冷却，离心（3500 r/min）处理10 min，取上清液置入光径比色杯，在波长532 nm处采取蒸馏水调零处理，比色测定A值，按公式计算MDA含量。

1.6.4 RGCs数目检测 慢性高眼压持续4周时，新西兰白兔应用大剂量速眠新注射液进行耳缘静脉内注射，深度麻醉后，摘取眼球，缝线定位角膜缘的6点以及12点钟位置，剪除角膜、虹膜、晶体以及玻璃体，将剩余眼球壁置于Bouin液中固定，24 h后应用二甲苯进行透明处理，常规浸蜡、石蜡包埋、切片（均通过视、6点钟以及12点钟方位）、染色以及封片，制成光镜切片后，利用HPIAS-1000图象测量系统计数RGCs数目，同时对视两侧5 cm范围内的RGCs数目进行测量。

1.7 统计学方法

应用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；相关性分析用Pearson检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 视网膜形态学改变

建模14 d后观察各组视网膜形态学改变，对照组：视网膜组织结构清晰，细胞核呈圆形或卵圆形，边缘清晰（图1A）；高眼压模型组：视网膜全层高度水肿，神经纤维层、外内丛状层明显水肿，细胞核肿胀，周围可见空泡变性（图1B）；治疗干预组：视网膜内丛状层发生肿胀，视网膜可见轻度萎缩，与高眼压模型组相比，程度较轻，内外核层密度较大（图1C）。

3 讨论

高眼压作为青光眼的主要独立危险因素[7-10]，能够显著增加致盲性眼病青光眼发生风险。而随着临床关于青光眼的深入研究，其相关病理机制研究证实，青光眼视神经损害的主要机制为视网膜神经节细胞发生进行性死亡，视神经纤维发生丢失。目前已知的对青光眼视神经节细胞凋亡具有促进作用的因素主要为神经营养因子剥夺、毒素兴奋性增加、细胞内钙离子超载、一氧化氮代谢紊乱、氧自由基过量、内皮素增多、细胞凋亡基因表达上升以及自体免疫机制异常等[11-13]。并且自由基对细胞衰老过程、小梁网细胞组成结构以及退行性改变具有重要影响。目前抑制视神经细胞凋亡、保护视神经已经成为临床防治青光眼的主要手段之一。SOD作为抗过氧化物酶之一，能对超氧阴离子歧化反应起催化作用，是活性氧的主要防御屏障，SOD活性降低，将导致自由基堆积。MDA作为脂质过氧化反应指标，能够损伤视网膜组织。

中药研究发现，藏红花不但镇静、祛痰、解痉、活血效果显著，而且具有良好的抗氧化、保护神经元作用。藏红花作为临床常用中药之一，主要功效为行气活血、祛瘀化痰。现代研究证实[14]，藏红花不仅能够抗肿瘤、抗氧化、降血脂、改善微循环，而且能够清除自由基，具有强效超氧化物清除活性，能够调节眼部血液血循，恢复视网膜功能。藏红花提取液有扩张血管、改善微循环的作用，可改善慢性高眼压导致的视网膜视神经缺血程度，显著保护视神经细胞[15]。

本实验中，在建立兔慢性高眼压模型的基础上，检测SOD活性、MDA含量以及RGCs数目，通过与正常兔和模型兔比较，证实了藏红花提取液能够显著减轻视网膜损伤程度，提高SOD活性，降低MDA含量，显著抑制视神经细胞凋亡。

综上所述，藏红花提取液能够降低慢性高眼压导致的视网膜损伤，具有保护视网膜功能的作用，值得临床深入探讨。

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（收稿日期：2014-05-06 本文编辑：程 铭）