海藻糖对阪崎肠杆菌温度耐受性的影响研究

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摘要 [目的]研究在磷酸缓冲液中添加不同浓度海藻糖的条件下阪崎肠杆菌对高温、低温的耐受性，为食品加工过程中控制阪崎肠杆菌污染提供参考。[方法]通过试验观察阪崎肠杆菌在不同温度条件下存活状况来反映其对温度的耐受性。[结果]阪崎肠杆菌在一定的高温条件下，其存活率与海藻糖的浓度成正比。 [结论]海藻糖对阪崎肠杆菌有保护作用，随着海藻糖浓度的升高，其保护作用越明显。

关键词 海藻糖；阪崎肠杆菌；温度；耐受性

中图分类号 TS201.6 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）09-0296-02

Effect of Trehalose on Tolerance of Enterobacter sakazakii to Temperature

LU Yu-dong YAN Chun-ming WANG Jin-yue HE Hong-juan ZHI Nan-nan YE Ying-wang *

（School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei Anhui 230009）

Abstract [Objective] The research aimed to determine tolerance of Enterobacter sakazakii to high and low temperature under the condition of adding different concentrations of trehalose in phosphate buffer solution，so as to provide reference for control of E.sakazakii contamination in the process of food processing.[Method] Survival situation of E.sakazakii was used to reflect the tolerance to conditions of heat and cold.[Result] E.sakazakii in a certain temperature，the survival rate was proportional to the concentration of trehalose.[Conclusion] Trehalose had a protective effect against inactivity of E.sakazakii and with the increasing concentrations of trehalose，the protective effect was more obvious.

Key words trehalose；Enterobacter sakazakii；temperature；tolerance

阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii），又名克罗诺杆菌（Cronobacter），是重要的食源性致病菌，能导致新生婴幼儿脑膜炎等严重疾病[1]。流行病数据显示婴幼儿奶粉是阪崎肠杆菌的重要传播媒介，然而至今科学家们还不清楚阪崎肠杆菌的在自然界中的污染来源[2-3]。研究表明，阪崎肠杆菌对低温和高温具有较强的耐受性。Iversen C等[4]研究表明阪崎肠杆菌能够产生一种胶囊状结构，这种结构提高了其附着物体表面和形成生物膜的能力，这种生物膜由胞外多糖、蛋白质等构成，有利于提高阪崎肠杆菌对外界环境的耐受性。因此，开展重要可溶性多糖――海藻糖对阪崎肠杆菌的温度耐受性影响研究，对预防和控制奶粉加工过程中阪崎肠杆菌生物污染意义重大。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株来源。阪崎肠杆菌标准菌株ATCC29544由本实验室保存。

1.1.2 试剂。pH=7.0的磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾13.600 g，氢氧化钠2.328 g用蒸馏水定容至2 000 mL），海藻糖，营养琼脂，营养肉汤；不同浓度的海藻糖：用pH=7.0的磷酸盐缓冲液分别配制0、3%、5%、10%、15%（m/v）的海藻糖溶液各100 mL，在无菌环境下用注射器进行过滤灭菌，并且编号。

1.1.3 仪器。培养皿，试管，锥形瓶，烧杯，玻璃棒，带盖广口瓶，移液枪（枪头），注射器，滤嘴，电热炉，恒温培养箱，恒温水浴锅，酒精灯，EP管，波长为253.7 nm的紫外灯。

1.2 试验方法

1.2.1 海藻糖对阪崎肠杆菌高温耐受性的影响。在不同温度（50、54、58、60 ℃）条件下，通过观察阪崎肠杆菌在不同浓度[0、3%、5%、10%、15%（m/V）]海藻糖溶液条件下的生长状况，分析海藻糖对阪崎肠杆菌的温度耐受性的影响。

将阪崎肠杆菌ATCC294544接种至营养肉汤培养基中，37 ℃恒温过夜培养，吸取5 μL过夜培养菌液用pH=7的磷酸盐缓冲液进行10倍稀释，将不同稀释菌液进行倾注培养，37 ℃恒温培养18 h后计数。取5支无菌试管，在无菌环境下分别准确移取0、3%、5%、10%、15%（m/v）的海藻糖溶液5 mL到对应试管，分别恒温水浴到50、54、58、60 ℃；在无菌环境下迅速向5支试管加入1 μL菌样，分别保温3、8、12 min。无菌环境下分别从保温3、8、12 min后的每个试管中分别3次移取1 mL菌液到灭菌处理过的培养皿中，立即倒入15～20 mL营养琼脂培养基，晃动培养皿使培养基与菌液混合均匀，并做标记，于37 ℃恒温培养18 h后计数。

1.2.2 海藻糖对阪崎肠杆菌低温耐受性的影响。在不同低温（4、-18 ℃）条件下，通过观察阪崎肠杆菌在不同浓度[0、3%、5%、10%、15%（m/v）]海藻糖溶液条件下的生长状况，分析海藻糖对阪崎肠杆菌的温度耐受性的影响。

将阪崎肠杆菌ATCC29544菌株进行活化培养，从中吸取5 μL菌液用pH=7的磷酸盐缓冲液稀释10倍，分别精确移取1 mL菌液至3个灭菌处理过的培养皿中，进行倾注培养，于37 ℃恒温培养18 h后计数作为原始数据。无菌环境下，准确移取一定浓度菌液5 μL于EP管中，然后移取0、5%、10%、15%的海藻糖溶液500 μL于上述EP管，混合均匀，密封；于-18、4 ℃保温，分别每隔4 h、30 d取出，30 ℃水浴溶解后。在无菌条件下，分别移取1 mL于营养琼脂培养基中进行倾注培养，于37 ℃恒温培养18 h后计数，观察细菌生长情况。

2 结果与分析

2.1 海藻糖对阪崎肠杆菌高温耐受性的影响

试验结果表明：于50 ℃处理8 min时，添加海藻糖与空白对照组阪崎肠杆菌菌株生长具有明显差异，海藻糖提高菌株的温度耐受性（图1a），而54 ℃处理时，阪崎肠杆菌生长与海藻糖浓度未见相关性（图1b）；海藻糖和热处理温度一定时，热处理时间越长，阪崎肠杆菌存活越少；热处理时间和海藻糖浓度一定时，热处理温度越高，阪崎肠杆菌存活数越少，温度达到58 ℃和60 ℃时，3 min就可以将其几乎全部杀灭。

2.2 海藻糖对阪崎肠杆菌低温耐受性的影响

试验结果表明：温度和低温处理时间一定时，阪崎肠杆菌存活率随着海藻糖浓度的升高而增大；海藻糖浓度一定时，-18 ℃低温处理时间越长，阪崎肠杆菌存活数量越少（图2a）。试验结果表明：4 ℃时，低温处理时间一定时，海藻糖浓度越大，阪崎肠杆菌存货数量越多（图2b）；海藻糖浓度一定时，处理时间越长阪崎肠杆菌存活数越少，但是4 ℃在海藻糖存在时，短时间内的处理对阪崎肠杆菌影响不是很大。

3 结论与讨论

阪崎肠杆菌是重要的食源性致病菌，阪崎肠杆菌在食品加工中通过高温、低温处理时，其存活率明显降低，添加海藻糖后，随着海藻糖浓度的增大，阪崎肠杆菌的存活数有显著提高。研究表明，外界环境恶劣时，阪崎肠杆菌通过在胞内积累海藻糖防止细菌脱水死亡[5]。同时，在大肠杆菌培养基中外源添加海藻糖也能提高大肠杆菌耐受逆境的能力[6]。细菌生物膜是由胞外多糖、蛋白质及DNA等构成，本研究通过外源添加形式研究阪崎肠杆菌对温度耐受性的影响，为食品加工过程中改进加工工艺来预防和控制该菌污染提供参考数据，并且可能说明营养成分丰富的食品对致病菌耐受逆境条件具有促进作用。

4 参考文献

[1] 吴清平，叶应旺，郭伟鹏，等.阪崎肠杆生物学特性及检测技术[J].微生物学通报，2006（6）：99-103.

[2] BIERING G，KARLSSON S，CLARK NVC，et al.Three cases of neonatal meningitis caused by Enterobacter sakazakii in powdered milk[J].J Clin Microbiol，1989（27）：2054-2056.

[3] CAUBILLA-BARRON J，HURRELL E，TOWNSEND S，et al.Genotypic and Phenotypic Analysis of Enterobacter sakazakii Strains from an Outbreak Resulting in Fatalities in a Neonatal Intensive Care Unit in France[J].J Clin Microbiol，2007（45）：3979-3985.

[4] IVERSEN C，FORSYTHE S.Risk profile of Enterobacter sakazakii，an emergent pathogen associated with infant milk formula[J].Trends Food Sci Technol，2003（14）：443-454.

[5] BREEUWER P，LARDEAU A，PETERZ M，et al.Desiccation and heat tolerance of Enterobacter sakazakii[J].J Appl Microbiol，2003（95）：967-973.

[6] WELSH D T，HERBERT R A.Osmotically induced intracellular trehalose，but not glycine betaine accumulation promotes desiccation tolerance in Escherichia coli[J].FEMS Microbiol Lett，1999（174）：57-63.