变性梯度凝胶电泳技术在发酵微生物多样性研究中应用

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摘要：研究发酵过程中微生物多样性情况对于了解微生物群落结构以及优势功能菌群的动态变化具有十分重要的意义。文章综述了变性梯度凝胶电泳技术的基本原理、研究方法及其在发酵微生物多样性研究中的应用，为该技术能够在发酵微生物分子生态学研究中得到更广泛的应用起到推动作用。

关键词：变性梯度凝胶电泳技术；发酵；微生物

中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2012）-11-0049-2

微生物发酵是利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。微生物发酵生产水平主要取决于微生物种类、菌种本身的遗传特性和培养条件。因此，微生物在发酵工程中起着核心作用。在发酵的各个阶段，不同的微生物发挥着不同的作用，研究发酵过程中微生物多样性情况对于了解微生物群落结构以及优势功能菌群的动态变化具有十分重要的意义。随着分子生物学的快速发展，环境微生物多样性免培养研究近年来逐步开展起来，该方法克服了经典培养方法的不足以及引起种群丢失等的缺陷，利用分子生物学技术准确高效地获得环境样品中各种微生物的菌落指纹和特征性核苷酸序列，确定微生物的多样性及其分类地位，揭示和丰富了生态环境的微生物资源，突破了环境微生物多样性研究的瓶颈，大大加速了微生物分子生态学的研究进程。其中基于核糖体RNA（rRNA）　分子标记的变性梯度凝胶电泳（Denaturing　Dradient　Gel　Electrophoresis，DGGE）技术，现已成为开展微生物物种多样性和动态变化研究的分子检测工具之一，广泛应用于微生物研究领域。

1　DGGE分析技术的原理

DGGE分析技术最早是由Fischer等[1]在1983年提出的一种检测点突变的电泳技术，Muyzer等[2]于1993年首次将这种技术应用于微生物群落结构研究中。该技术是使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶对一组特定引物所扩增出的具有相同长度的特定DN段进行电泳，因为特定片段碱基序列不同，这就决定了它们具有不同的解链区域，因此在进行变性梯度凝胶电泳时，长度相同而在碱基序列上存在差异的DNA双链的解链需要不同的变性剂浓度。序列不同的DNA　片段就会在各自适合的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致迁移率急剧下降，最终会停到胶的某一特定位置，这样就可以把不同序列的DN段分离开来。

2　DGGE技术的研究方法

2.1　发酵微生物宏基因组DNA的提取和PCR扩增反应

宏基因组DNA的提取是开展发酵微生物多样性研究的基础，从发酵样品中进行微生物DNA的主要提取方法包括直接提取法和间接提取法。直接提取法即利用化学、物理和酶等手段直接作用于发酵样品后提取DNA。常用的物理法主要有冻融和玻璃珠搅拌法等。化学法主要有SDS法[3]和酶裂解法[4]等。间接法与直接法的主要区别是将发酵基质与微生物先进行分离再提取微生物DNA。

2.2　DGGE电泳及图谱分析

目前在DGGE技术的应用研究中，多采用DcodeTM基因突变检测系统（Bio-Rad，USA）进行对PCR产物的DGGE电泳分离。聚丙烯酰胺凝胶（丙稀酰胺：双丙稀酰胺=37.5：1）浓度为8%，变性剂浓度范围多为30%～55%，180V电压下，60℃恒温，1×TAE缓冲液电泳，电泳时间根据目的产物大小而定。电泳结束后，进行染色，染色方法包括溴化乙锭（EB）、SYBR　Green、SYBR　Gold和银染法，染色结束后在凝胶成像系统中拍照。利用生物信息学软件对DGGE　图谱进行分析，明确不同处理的电泳条带多少和丰度值。

2.3　DGGE条带的回收和序列分析

根据实验目的不同可开展条带的回收和序列分析，选取各处理中目的条带进行产物回收，并以此为模板进行2次PCR扩增，连接转化后，通过菌落PCR和酶切验证克隆后，提取质粒，交由生物公司测序。将测序结果提交到GenBank中进行Blast比对分析，采用生物信息学软件分析序列，确定微生物种类，并提交序列。

3　DGGE技术在发酵微生物多样性研究中的应用

3.1　DGGE技术在发酵细菌多样性研究中的应用

Ercolini等[5]（2003）通过扩增V3区和V4-V5区的DGGE　发现英格兰传统奶酪Stilton是由植物乳杆菌、卷曲乳杆菌、乳酸乳球菌等复杂的微生物组成。Cocolin等[6]（2005）应用培养法和免培养法的DGGE分析技术研究了意大利东北部的3种天然发酵腊肠中的微生物生态，发现腊肠中存在卷曲乳杆菌和沙克乳杆菌。邢德峰等[7]（2005）应用DGGE技术分析了产氢发酵系统微生物群落动态及种群多样性。间隔7d　从反应器取厌氧活性污泥，获得污泥微生物群落的16S　rDNA　指纹图谱。梁新乐等[8]（2008）采用DGGE法研究了泡菜中微生物群落结构的多样性，并明确了微生物的种类和组成。韩吉雨等[9]（2009）采用DGGE方法分析了玉米及苜蓿青贮动态发酵体系中细菌菌群多样性，发现大多数序列代表乳酸菌（LAB）类细菌，并以Lactobacillus类最多；其次为Lactococcus和Weissella。陈长卿等[10]（2012）采用DGGE技术分析了草菇以废棉为主要成分的培养料在二次发酵过程中细菌群落结构变化情况，细菌群落多样性较为丰富，条带多样性随着发酵进程逐渐降低，而且在不同阶段中的优势条带及相对丰度在发生着动态的变化。回收克隆的23个不同发酵阶段的优势菌株来自于Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes3个菌门的11个属，其中19株克隆菌株为耐热细菌，在发酵的高温及降温阶段，Stenotrophomonas、Comamonas、Sphingobacterium和Sinorhizobium属细菌为优势类群。

3.2　DGGE技术在发酵真菌多样性研究中的应用

相比DGGE技术在发酵细菌多样性研究中的广泛应用，关于在真菌中的应用研究报道并不多。Cocolin[11]在2000年建立了一种有效检测酵母的DGGE方法，并利用DGGE技术检测了实验室小规模发酵酒中的酵母，可以鉴定至少4种不同的酵母[12]。Nielsen等运用DGGE技术分析了加纳可可发酵过程的酵母数量，在大部分发酵过程均检测到了汉森酵母、假丝酵母和毕赤酵母的某些种，推测这些微生物在可可发酵过程可能起着重要作用[13]。高秀芝等[14]（2011）以天源酱园生产豆酱为研究对象，通过PCR-DGGE　指纹图谱技术分析豆酱发酵过程中微生物群落动态变化，发现豆酱发酵过程中主要真菌为米曲霉（Aspergillus　oryzae，相似率99%）　的近缘种，在豆酱发酵前期分解原料中蛋白质和淀粉。

参考文献

[1] Fischer　S　G，Lerman　L　S.DNA　fragments　differing　by　single　base-pair　substitutions　are　separated　in　denaturing　gradient　gels：Correspondence　with　melting　theory[J].Proc　Natl　Acad　Sci，　1983，80：1579-1583.

[2] Muyzer　G，Waal　E　C，Uitterlinden　A　G.Profiling　of　complex　microbial　populations　by　denaturing　gradient　gel　electrophoresis　analysis　of　polymerase　chain　reaction　amplified　genes　encoding　for　16S　rRNA[J].Appl　Environ　Microbiol，1993，59：695-700.

[3] Zhou　J，Bruns　MA，Tiedje　JM.DNA　recovery　from　soils　of　diverse　composition[J].Appl　Environ　Microbiol.1996，62（2）：316-322.

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[7] 邢德峰，任南琪，宋业颖，等.DG-DGGE分析产氢发酵系统微生物群落动态及种群多样性[J].生态学报，2005，25（7）：1818-1823.

[8] 梁新乐，朱扬玲，蒋予箭，等.PCR-DGGE法研究泡菜中微生物群落结构的多样性[J].中国食品学报，2008，8（3）：133-137.

[9] 韩吉雨，王海荣，侯先志，等.PCR-DGGE方法分析玉米及苜蓿青贮动态发酵体系中菌群多样性[J].安徽农业科学，2009，37（19）：8888-8892.

[10] 陈长卿，姜云，孟丽，等.变性梯度凝胶电泳分析草菇培

养料二次发酵过程中细菌群落演替[J].微生物学报，2012，52（8）：

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[12]　Cocolin　L，Heisey　A，Mills　D　A.Direct　identification　of　the　indigenous　yeasts　in　commercial　wine　fermentations[J].Am　J　Enol　Vitic，2001a，52：49-53.

[13] Nielsen　D　S，Honholt　S，Tano-　Debrah　K，et　al.Yeast　populations　associated　with　Ghanaian　cocoa　fermentations　analysed　using　denaturing　gradient　gel　electrophoresis　（DGGE）　[J].Yeast，2005，22（4）：271-284.

[14] 高秀芝，王小芬，刘慧，等.PCR-DGGE分析天源酱园豆酱发酵过程中微生物多样性[J].食品科学，2011，32（1）：112-114.

作者简介：高跃函（1982-），女，吉林桦甸人，长春建筑学院助教，研究方向：生物工程。