藏茵陈川西獐牙菜的生物学研究

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摘要：藏药藏茵陈川西獐牙菜是传统高寒藏药，在治疗肝胆疾病方面具有独特疗效，已成为目前研究的热点。文章系统查阅近20年国内外有关川西獐牙菜的研究进展，对川西獐牙菜生物学特性及资源分布、组织培养、分子生物学和引种栽培研究的进展进行分析、概括和总结，为藏茵陈资源保护和可持续发展提供科学的参考依据，对地区生物、生态多样性保护起到积极作用。

关键词：藏药；川西獐牙菜；研究进展；分子生物学

基金资助：国家自然科学基金项目（No.81274185，No.81373765），教育部新世纪优秀人才支持计划项目（No.NCET-12-0578，No.NCET-13-0624），高等学校学科创新引智计划项目（No.B08044），中央民族大学一流大学一流学科建设项目（No.YLDX01013）藏药藏茵陈，藏名“桑蒂”，是传统高寒藏药，始载于藏医药书《四部医典》[1]，是藏药中具有特色的治疗热症、肝胆病及血液病的常用药物[2]。

中国是肝炎大国，肝炎已成为严重危害人民健康的疑难病之一，而藏茵陈以长期的民间药用基础和确切的疗效倍受人们的关注。广义藏茵陈主要包括獐牙菜属Swertia、花锚属Halenia、喉毛花属Comastoma、胁柱花属Lomatogonium等的数种植物。由于藏区地域辽阔，居住分散，加之受到地理、资源、交通、信息等诸多方面的限制，不同地区藏医药工作者使用的“桑蒂”的来源也不尽相同。现代藏医药研究者普遍认为，藏茵陈正品应是川西獐牙菜[3]。川西獐牙菜性寒、味苦，有保肝退黄的功效，安全无毒，无不良反应[4]。川西獐牙菜主要化学成分是酮类、环烯醚萜类（獐牙菜苦苷、龙胆苦苷等）、三萜类（齐墩果酸、乌苏酸等）等化合物[5-6]。酮类具有保肝、抗氧化、抗病毒、抗炎性反应、降血糖等活性[7-9]。獐牙菜苦苷具有抗癌、抗肿瘤、抑制中枢神经系统、改善胃肠道功能等作用[10-12]。齐墩果酸对神经元损伤有一定的保护作用[13]。随着市场对藏茵陈的需求量越来越大，资源短缺越来越明显。市场上的藏茵陈主要来源于野生资源，长期采挖野生藏茵陈不但使资源量锐减，生态环境也遭到不同程度的破坏，已经严重影响到藏药的使用[14]。本文综述了近年来藏茵陈川西獐牙菜在生物学特性和资源分布、组织培养、分子生物学及引种栽培方面的研究概况，为藏茵陈的研发与保护野生资源提供理论依据。

川西獐牙菜的生物学特性和资源分布特点

川西獐牙菜是龙胆科（Gentianaceae）獐牙菜属（Swertia）的一年生草本，高15-60cm。主根明显，淡黄色。茎直立，四棱形；叶无柄；圆锥状复聚伞花序多花；花4数；种子深褐色，椭圆形。花果期7-10月[15]。川西獐牙菜主要分布于我国、云南（德钦）、青海西南部、四川西北部，资源多分布于大山大河的山坡河谷两旁的草丛、河滩、草甸及灌丛，川西獐牙菜的分布与横断山脉及水资源分布一致[16]。

川西獐牙菜的体细胞杂交和组织培养研究

植物体细胞杂交可以克服远缘有性杂交不亲和性，将异源遗传物质转入受体。赵军胜等[17]将川西獐牙菜原生质体经紫外线照射后，与胡萝卜原生质体在PEG诱导下融合，产生了体细胞杂种。经过对融合杂种细胞再生系分析得知，各再生细胞均存在双亲核DNA及重组DNA[18]。WangJ等[19]还将来自狭叶柴胡和川西獐牙菜愈伤组织的原生质体进行融合，产生杂交细胞系。检测发现，一些愈伤组织中具有来自川西獐牙菜（供体）的SmG10H（香叶醇-10羟化酶）基因，并产生獐牙菜苦苷等，并且有些愈伤组织比川西獐牙菜（供体）本身产生更多的獐牙菜苦苷。这说明可以用体细胞杂交方法获得川西獐牙菜的有效成分。杨莉娜等[20]以川西獐牙菜的茎尖和茎节为外植体，研究了不同激素配比对其丛生芽诱导和生根培养的影响，结果发现茎尖为川西獐牙菜丛生芽诱导的适宜外植体。

川西獐牙菜的分子生物学研究

川西獐牙菜的分子生物学研究主要分为两个方面，一是对川西獐牙菜进行真伪鉴定，二是关于川西獐牙菜有效物质代谢途径关键酶的基因克隆方面。1.川西獐牙菜的真伪研究在藏茵陈植物中，川西獐牙菜是藏茵陈正品，因其资源量有限而出现了很多替代植物，但这些替代植物与川西獐牙菜之间在药效方面有着一定的差异性，利用分子生物学技术可以较好地解决藏茵陈的种类鉴定。刘建全等[21]利用DNA分子遗传标记技术，对川西獐牙菜与其混淆种类核糖体DNAITS序列进行了比较，结果显示，川西獐牙菜与易混淆种之间存在一定的分子序列差异。因此，ITS序列可正确鉴定川西獐牙菜与其混淆种类。李小娟等根据藏茵陈原植物川西獐牙菜特异性的分子片段，设计专用于鉴别川西獐牙菜PCR引物，建立只有正品川西獐牙菜才具有的阳性扩增PCR鉴别条件[22-23]。YuMT等[24]研究认为，5SrRNA基因间隔序列可以作为分子鉴定标记区别獐牙菜和同属其他常见混淆品。2.川西獐牙菜的基因克隆研究川西獐牙菜的基因克隆主要集中在獐牙菜苦苷代谢途径关键酶——香叶醇-10羟化酶基因方面的研究。獐牙菜苦苷属于环烯醚萜类化合物，它们的生物合成途径尚未完全已知。但是香叶醇的氧化被认为是烯醚萜类化合物合成途径中第一个限速步骤，此反应由香叶醇-10羟化酶催化香叶醇C10位的甲基羟基化，生成10-羟基香叶醇[25]。WangJ等[26]采用RACE-PCR技术，克隆了獐牙菜苦苷合成的关键酶基因——香叶醇-10羟化酶基因全长cDNA，命名为SmG10H。该基因开放阅读框核苷酸长度为1488bp，编码的蛋白质具有495个氨基酸，分子量为55.45kDa，能在大肠杆菌和酵母中表达，并且表达产物具有香叶醇-10羟化酶活性。截至2015年4月川西獐牙菜在NCBI上登录的基因序列仅有5条，除上述香叶醇-10羟化酶基因以外，还有4条。笔者认为，对川西獐牙菜的鉴定完全可以采用现代分子生物学技术，但对于其基因方面的研究还是太少，有待于进一步的研究。川西獐牙菜的引种栽培研究川西獐牙菜引种栽培的研究主要集中在种子萌发、驯化栽培、适宜种植区划等方面。1.种子萌发研究川西獐牙菜种子极小，且有休眠期，自然萌发率较低[27]。川西獐牙菜种子种皮厚，透水性和透气性较弱，为硬实种子，因而外界氧气不易透进种子内，从而抑制了种子的萌发[28]。研究表明，植物激素（吲哚乙酸IAA、赤霉素GA3）、低温、超声波等[28-29]处理对种子的发芽率都有显著提高。2.藏茵陈川西獐牙菜的引种栽培研究由于无节制的采挖使野生的藏茵陈川西獐牙菜资源处于枯竭状态。引种栽培是解决资源匮乏的重要途径，现在引种栽培大致分为两个方面：①原产地引种栽培，王才桑洁[30]和李冬鸣等[31]对野生川西獐牙菜和人工种植品种（玉树）分别进行了检测，结果人工种植植株的獐牙菜苦苷等含量基本上和野生的相等。②异地引种栽培，拉本等[32]测得川西獐牙菜人工栽培品种（西宁，平均海拔低于玉树2000m）与野生品种（玉树）有效成分含量相当，这些都说明了引种栽培的可行性。黄林芳等[16]以实地调查、标本查阅和文献研究为基础，采用《中药材产地适宜性分析地理信息系统》（TCMGIS）提取藏茵陈主产区的生态因子范围，并以此为依据对藏茵陈在全国的生态适宜性进行分析，得出适宜区主要位于、四川、甘肃、青海等。

展望

随着人类社会的不断进步，疾病医疗模式已由单纯的疾病治疗转变为预防、保健、治疗、康复相结合的模式，传统医学正发挥着越来越大的作用，对中草药的研究取得了前所未有的发展。我国中草药应用历史悠久，经验丰富，对中草药的研究与开发具有得天独厚的基础优势，为了更好地开发利用川西獐牙菜这一民族植物药资源，同时也为相关学科的研究提供参考依据，有必要对该植物做进一步的研究。一是应加大引种栽培方面的研究。目前由于川西獐牙菜野生资源匮乏，引种栽培迫在眉急，但是川西獐牙菜的引种栽培现在都仅限于海拔较高条件下进行，而不能扩展到低海拔地区进行引种栽培种植。故应对其是否能够在更大海拔范围内进行引种栽培开展研究，对比低海拔地区引种栽培后的有效成分是否有所改变等。二是应加强川西獐牙菜的分子生物学研究。目前对川西獐牙菜的分子研究有限，现有文献中仅有关于獐牙菜苦苷代谢途径关键酶——香叶醇-10羟化酶基因的报道，我们对其基因组信息所知甚少，特别是对于药用有效成分的酮等生物合成路径所知甚少，还无法通过体外生物合成路径合成有效物质。故应该运用分子生物学实验方法与生物信息学知识对川西獐牙菜的有效成分酮的生物合成关键酶基因进行研究，确定酮生物合成路径，最终通过体外生物合成路径能够体外合成酮。只有通过对川西獐牙菜广泛而深入的研究，才能为该植物的利用和保护提供技术保证，且只有在适宜区域进行人工引种栽培、规模发展，才能有效解决藏茵陈药源紧缺等问题，并保护野生资源。

作者：马徐 刘越 冯晓晓 张琳霞 孙洪波 陈川川 王敏利 马晓清 唐丽 单位：中央民族大学生命与环境科学学院 中国中医科学院中药资源研究中心