胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展
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[中图分类号] R318 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）06（c）-008-02
自1981年英国的Evans等[1]和美国的Martin[2]相继从小鼠囊胚的内细胞团分离建立胚胎干细胞系以来，胚胎干细胞体外诱导分化的研究就一直是各国学者感兴趣的课题。目前，已从胚胎干细胞体外诱导出卵黄囊、血岛、神经细胞、心肌细胞、血管和内皮等结构及细胞。利用胚胎干细胞体外诱导分化的成果可望发展出治疗多种疾病的新方法，将在人体早期发育、基因功能、药物开发、细胞治疗和组织器官替代治疗中发挥重要作用，并成为组织器官移植的新资源。
1 ＥＳ细胞的特性
胚胎干细胞(embryonic stem cell,ＥＳ细胞)是从早期胚胎（桑椹胚、囊胚）或原始生殖细胞(primordial germ cell，PGCS)分离出来的能在体外永久培养的、具有多方向分化潜能和种系嵌合能力的细胞系。目前有关ＥＳ细胞特征的研究主要来源于小鼠的实验。
小鼠ＥＳ细胞系的特征包括：①能大量繁殖并保持未分化状态；②在一定条件下具有向三个胚层组织和细胞分化的全能性；③能够形成嵌合体动物，即ＥＳ，细胞具有种系传递功能；④易于进行基因改造操作。
2 ＥＳ细胞体外诱导分化的细胞类型或结构
新近大部分胚胎干细胞诱导类型分化的实验都集中在小鼠实验中，小鼠胚胎干细胞在体外分化的细胞类型或结构主要有下列几种：
2.1 造血细胞
Wiles提出了ES细胞体外分化产生红细胞、髓细胞和淋巴细胞等一系列造血系统的细胞的报道[3]。这表明在合适的培养条件下，ＥＳ细胞是可以分化为造血细胞，但是这种条件中需有胎牛血清，在此血清中含有一些因子，对ＥＳ细胞向造血细胞分化起着重要作用。如果没有胎牛血清，ＥＳ细胞向造血细胞分化的效率极低。有学者发现ES细胞用β-巯基乙醇(β-ME)等药物处理，可发育成拟胚体(EB)。然后，用胰蛋白酶消化成单个细胞，经干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和胚胎细胞条件培养液处理，可使其定向分化为造血干细胞[4]。这一重要进展不仅为分析研究ES细胞分化，为造血干细胞的早期决定及分化机制和过程提供了实验模型，而且也为临床上移植或输血应用的血液找到了一个新的突破口。
2.2 血管和内皮细胞
丛笑倩等[5]将小鼠ES细胞单层培养在含重组转化生长因子β1(TGF-β1)的Ⅰ型胶原蛋白为基质的三维系统内，或直接将过度表达TGF-β1的ES细胞单层培养在Ⅰ型胶原蛋白为基质的三维系统内都能获得内皮细胞组成的血管样结构。此外用重组TGF-β1处理的ES细胞中，能检测到碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因表达。这些结果提示TGF-β1可能调节ES细胞和(或)其分化细胞的bFGF基因表达,bFGF可能作为血管内皮细胞的生长因子之一促进内皮细胞分化和形成血管。随后Balconi等[6]在Vinel研究的基础上通过免疫磁珠分离的方法将分化出的内皮细胞纯化出来。由此可以看出ＥＳ细胞体外分化系统是研究内皮细胞与血管发生的细胞和分子机制的较理想模型。
2.3 心肌细胞和肌肉细胞
悬浮或悬滴培养的小鼠ＥＳ细胞的拟胚体(ＥＢ)在维甲酸(ＲＡ)诱导条件下贴壁生长数天，常出现某些具节律性自发收缩活力的分化细胞集落。电镜观察证实，收缩的细胞内存在着肌原纤维和肌小节和闰盘等典型的心肌细胞特有结构。如将小鼠ＥＳ拟胚体与畸胎瘤细胞(EC)衍生的内胚层样END-2细胞联合培养，也可观察到ＥＳ细胞被诱导分化为有节律搏动的心肌细胞和骨骼肌细胞现象。为探究心肌细胞是怎样形成的,近年来人们进行了不少研究，研究的主要目的就是要弄清：①心肌细胞是怎样由它的前身细胞分化而来；②心肌基因表达及不同离子通道的功能表达之间的关系；③形态和离子通道调控变化的关系。与已分化细胞相比，人们对心肌前体细胞的功能特征的认识知之甚少，原因是此时鼠胚体积小，其前体又缺乏横纹和自发性收缩的特性，很难鉴定。现在用ＥＳ细胞研究可很好地解决这些问题。Kolossov等[7]研究发现：电位依赖性Ｌ型Ca2+离子通道(VDCC)是心肌细胞早期发育的标志，而三磷酸肌醇受体(IP3R)肌浆网Ca-ATPase早在心肌细胞形成前就已表达。关于心肌细胞形成过程中不同阶段ＥＳ细胞的作用，有望应用选择性药理。
2.4 神经细胞
单层培养ＥＳ细胞在10 μmol/Ｌ维甲酸与1 mmol/L双丁酰基环腺苷磷酸(db-cAMP)的共同作用下，90%～95%的分化细胞为神经胶质细胞。ＥＳ细胞、ＥＢ在特定条件贴壁培养时也能被诱导分化为神经元，但效率不高。而用悬浮培养4 d的ＥＢ在含ＲＡ的培养液中继续培养4 d，再使ＥＢ贴壁培养则可高效重复地分化出神经细胞。人们设想将ＥＳ细胞分化而来的定向细胞进行移植，但移植后形成异质组织和畸胎瘤的问题一直困扰着人们。不过，有学者发现将由ＥＳ细胞衍化而来的少突神经胶质细胞移植到骨髓鞘缺陷型(ＭＤ)大鼠胚胎的大脑脑室中，这些细胞会广泛分布，并形成新的髓鞘质，且未见受体鼠内形成非神经组织和有肿瘤形成的迹象，因ＭＤ型大鼠是人类遗传性髓鞘疾病(ＰＭＤ)的模型，他们将衍化胶质细胞移植到动物模型的骨髓，发现髓鞘生长良好[8]。这些实验为将来人类攻克疾病奠定基础。
2.5 肝细胞
胡安斌[9]报道小鼠胚胎发育时,肝芽在第9 天出现,这个阶段,肝细胞受与肝芽相邻的心脏横膈膜分泌的aFGF的影响,aFGF[10]被认为是肝细胞发生的最重要的细胞生长因子。选用aFGF、HGF 及胶原基质(白明胶) 作为诱导方法和诱导因子,是想模拟体内肝细胞发生及发育的内环境,促进胚胎干细胞向肝细胞分化。定向诱导细胞培养上清中ALB 在第11 天出现，并持续上升,说明分化细胞已有产生ALB 的功能并分泌到胞旁，ALB 为肝细胞特有分泌蛋白，显示分化系统中有肝细胞的出现，ALB 随着分化细胞中肝细胞数量和功能的加强而在上清中浓度增加。丛效倩[11]等报道通过与HGF、β－NGF、RA和BNL.CL细胞共同培养，可以使胚胎干细胞向肝细胞定向分化。
2.6 其他分化细胞
除上述分化细胞外，其他的分化细胞也陆续被报道。如脂肪细胞[12](EB在二甲亚砜诱导后,加入胰岛素、三碘甲腺原氨酸、胎牛血清)、软骨细胞[13](骨形态发生蛋白2及骨形态发生蛋白4)、平滑肌细胞[14](ＲＡ及环化腺苷酸)、骨细胞[12](地塞米松及磷酸甘油)、胰岛素分泌细胞[15](基因转染)等。
以培养环境进行诱导，将胚胎干细胞与要诱导分化的细胞共同培养也有成功的例子报道，如张仁礼等将小鼠ＥＳ细胞与人羊膜共培养,结果表明与羊膜共培养可诱导ＥＳ分化为表皮样干细胞[16]。YongpingLi等[17]将ＥＳ细胞注入特定的眼内环境，发现ＥＳ细胞可以在眼内形成视网膜样结构，产生视网膜神经节细胞样细胞。以培养环境进行诱导方式的成功报道为ＥＳ细胞体外诱导分化研究探索了一条新途径，同时也为临床治疗疾病提供一个崭新的方法，可望改写许多疾病病变的传统治疗模式。
人和灵长类动物的ＥＳ细胞对培养条件要求更为严格，必须要有饲养层的存在，仅靠白血病抑制因子(LIF)是无法抑制其分化的[18]。最近有学者[19]观察到碱性成纤维细胞生长因了(bFGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、骨形态发生蛋白4(BMP-4)、造血生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)等人体8种生长因子可诱导人ＥＳ细胞体外分化。在人ＥＳ细胞形成聚集体后再分散培养，在分散细胞生长成单层细胞后，再进行干预研究。结果表明：在没有生长因子作用时，人ＥＳ细胞能自发分化成不同类型的细胞，而生长因子的作用将产生更多形态成熟的细胞。没有一种生长因子能把人ＥＳ细胞定向诱导分化为一种特定细胞，而仅仅是增加某一种类型细胞的相对数量。看来，人ＥＳ细胞分化研究还有许多问题有待解决。
3 ES细胞系应用展望及存在问题
综上所述，ES细胞是研究哺乳动物早期胚胎发育的理想模型,有着广阔的应用前景。迄今，关于ES细胞演化的心肌细胞、神经细胞前体、造血细胞前体的动物移植已有报道。除移植受体的长期存活率有待考察外，异体排斥反应尚待通过组织相容性测验、基因调控及核转移等方法得到解决；传统上，多用转基因或基因敲除动物模型作为基因功能分析方法，但周期较长。而利用ES细胞系可通过基因缺失和过度表达两种途径进行研究，周期较短；EB可用于某种新药或化学物质的毒性及效能的评估。这对药理学、农业化肥工业等领域的发展有重要意义。
[参考文献]
[1]Evans MJ,Kaufman MH.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J].Nature,1981,292（9）:154-156.
[2]Martin GR. Isolation of pluropotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,1981,78（12）:7634-7638.
[3]Wiles MV,Keller G.Multiple hematopoietic lineages develop from embryonic stem cells in culture[J].Develoment,1991,111（2）:259-267.
[4]Pacacios R,Golunski E,Samaridig J.In vitro generation of hematopoietic stem cells from an embryonic stem cell lines[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1999,92（9）:7530-7534.
[5]丛笑倩,夏汉顺,徐露露,等.外源TGF-β1基因在小鼠ＥＳ细胞中的表达及其对细胞分化的影响[J].实验生物学报，1996，29（3）：273－289.
[6]Balconi G,Spagnuolo R,Dejana E.Development of endothelial cell lines from embryonic stem cells: a tool for studying genetically manipulated endothelial cells in vitro[J].Arteriogeler Thromb Vage Biol,2000,20（6）:1443-1451.
[7]Kolossov E, Fleischmann BK, Liu Q, et al. Functional characteristics of ES cell - derived cardiac precursor cells identified by tissue-specific empression of the green fluorescent protein[J].J Cell Bio, 1998,143(7):2045-2056.
[8]Bain G, Kitchens D, Yao M, et al. Embryonic stem cells express neuronal propertied in vitro[J]. Dev Biol, 1995,168（2）:342-357.
[9]胡安斌，蔡继业，郑启昌，等. 胚胎干细胞向肝细胞定向诱导分化的体外实验研究[J].中华医学杂志，2003,83（18）：1592－1596.
[10]Jung J , Zheng M, Goldfarb M, et al.Initiation of mammalian liver development from endoderm by fibroblast growth factors[J].Science,1999,284（5422）:1998－2003.
[11]丛学笑，李秀兰，萧树东.小鼠胚胎干细胞诱导为肝细胞的研究[J].中国胃肠病学杂志，2003，8（1）：6－10.
[12]Dani C, Smith A G, Dessolin S, et al. Differentiation of embryonic stem cells into adipocytes in vitro[J].J Cell Sci,1997,110( Pt 11):1279-1285.
[13]Kramer J, Hegerl C, Guan K, et al. Embryonic stem cell-derived chindrogenic differentiation in vitro: activation by BMP-2 and BMP-4. Mech Dev,2000,92 (10):193-199.
[14]Drab M, Haller H, Bychkov R, et al. From totipoent embryonic stem cells to spontaneously contraning smooth muscle cells: a retinoic acid and db-cAMP in vitro differentiation mode[J].FASEB J, 1997,11（11）:905-915.
[15]Bernal Soria, Enripue Roche, Genoveva Berna, et al. Insulin-sevreting cells derives from embryonic stem cells normalize glycemia in streplozolocin-induced diabetic mice[J].Diabetes, 2000,49(2):157-162.
[16]张仁礼,李海标.胚胎干细胞向表皮样干细胞分化体外条件的研究[J].解剖学研究,2001,23(3):201-203.
[17]Yongping Li,Jian Ge,Jianhua Yan,et al.Differentiation of embryonic stem cells into neutons and tetina-like structure in nude mice[J].Eye Science,1999,15(5):131-133.
[18]Thomson JA,Kalishman J,Dolos TG,et al.Isolation of a primate embryonic stem cell line[J].Proceedings of the National Academy of science USA,1999,92(17):7844-7888.
[19]徐令,黄绍良,李树容,等.人的类胚胎干细胞的分离和培养[J].中山医科大学学报,1998,19(1):77-80.
（收稿日期：2007-04-12）
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