糖尿病肾病微循环障碍发生机制及中药复方干预作用
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摘要：目的：观察中药复方对早期糖尿病肾病大鼠肾脏血流动力学影响及其机制。方法：采用高糖高脂饲料喂养及腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法建立了早期糖尿病肾病(DN)大鼠模型。检测血糖，尿微量白蛋白(UAIB)，肾小球滤过率(GFR)，血栓素(TXB)，6-酮前列腺素(6-keto-PGF)水平，并用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测肾皮质中血小板衍化生长因子-B(PDGF-B)基因水平。结果：DN大鼠血糖，UAIb及TXB明显升高，6-keto-PGF下降及肾皮质PDGF-B基因表达明显上调。用中药复方治疗后血糖，UAIb及TXB下降，6-keto-PGF增高，下调PDGF-B基因的过度表达，并发现PDGF―B基因水平与UAIb、TXB2均呈正相关(γ=0.5204，0.5011，P
关键词：中药复方；糖尿病肾病；At小板衍化生长因子-B基因；微循环
中图分类号：R285.5
文献标识码：A
文章编号：1673-7717(2007)12-2605-04
糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DN)微血管并发症之一。肾脏血流动力学改变异常是DN微循环障碍的早期表现，在其发病中起关键作用。血流动力学异常是造成DN蛋白尿及肾小球硬化的重要原因之一。在西方国家DN已成为终末期肾病的首要原因。早期DN突出表现为肾小球高滤过、肾脏肥大和间断性尿蛋白的排泄率增加。持续的血流动力学异常可导致微血管结构损伤。目前研究认为与肾小球血液动力学相关的主要细胞因子有血小板源生长因子(PDGF)。为此本文探讨DN肾脏内PDGF基因水平与肾内微循环的关系，旨在揭示DN发病机理及其药效学机制。
1.材料和方法
1.1材料实验于2005年1月-2005年12月在总医院实验动物中心。选择SPF级Wistar大鼠72只，雄性，体重(200±20)g，由总医院实验动物中心提供。动物使用许可证：SYXK(军2002-019)。
1.2中药复方制剂 由黄芪、黄精、山药、大黄、丹参、茯苓、泽泻及益母草药物组成，购于总医院药局，由总医院中药局制剂室煎制。
1.3链脲佐菌素(STZ) 为美国Sigma公司产品，购于北京邦定泰克生物制药有限公司。临用前溶于0.1mol/L，pH4.2的无菌枸橼酸钠缓冲液配成1％溶液。
2.实验方法
2.1DN大鼠模型的建立选取健康雄性Wistar大鼠72只，适应性饲养1周。1周后随机选12只为正常对厢组，给予普通饲料，余60只给予高糖高脂饲料，喂养1个月后造模。造模前禁食12h，然后以50mg/kg STZ一次腹腔注射，正常对照组注入等容量枸橼酸缓冲液。72h后大鼠眼眶采血测定空腹血糖(FBG)，造模过程中死亡1只，血糖值未达标3只。血糖值大于16.7mmol/L的56只，列入观察对象。
2.2动物分组及给药 将造模成功的56只DN大鼠，按血糖进行随机区组设计分为5组，即模型组、中药低、高剂量治疗组和预防组，每组14只，另12只为正常对照组，共计5组。预防组在成模后立即开始给药，治疗组在成模后2周开始给药。中药治疗组剂量按人体―大鼠体表面积此值换算出大鼠的等效剂量。预防组与低剂量组给予10.15g/(kg・d)；高剂量组给予20.30g/(kg・d)按1mL/100g体重灌胃；正常对照组及模型组按1mL/100g体重灌服相应容量的生理盐水，各组每天灌胃1次，连续6周。大鼠自由饮水，进食，不使用胰岛素和其它降糖药。
2.3标本收集 处死前一天用代谢笼收集24h尿液，离心，去除沉渣，一20℃保存待测。实验期间采血，用乙醚轻度麻醉，眼眶静脉取血。各组大鼠实验6周后用3％水合氯醛麻醉，颈动脉取血后处死。处死前测空腹血糖。制备血清，4℃3000 r/min离心5min，取上清-20℃保存待测。并将右侧肾称重后冰浴下快速取肾脏，分离肾皮质，于液氮中冻透后保存于-70℃冰箱备用，待测分子生物学指标。
2.4观察指标 血糖、尿微量白蛋白、肾小球滤过率、血栓素、6-酮前列腺素及PDGF-B基因。 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肾皮质PDGF-B的基因水平，对其表达进行半定量分析。 PDGF-B、β-actin引物由大连宝生物有限公司合成，序列见表1。
2.5RT-PCR法肾皮质PDGF-B基因检测步骤①肾皮质总RNA提取(采用Trizol试剂)：②逆转录(按大连宝生物工程有限公司cDNA合成试剂盒进行操作)：将反应管放入扩增仪(PCR)内，按55℃1min，30℃5min，15～30min内匀速升温至55℃，55℃15～30min，98℃5min和5℃5min的条件进行逆转录反应。③PCR扩增：反应液混匀后按以下条件进行扩增：94℃5min预变性，变性与退火温度及时间见表2，72℃引物延伸1min，循环后72℃延伸5min。
④电泳(PCR产物分析)：以DNAmaker为标准，结果用自动电泳凝胶分析系统对每一样品PCR产物扩增的特异性片段进行光密度扫描，并以β-acfin密度作为参考定量标准。根据特异扩增片段(IOD)/B-acfin(IOD)的比值，对目的基因片段的mRNA表达水平进行半定量分析。
2.6统计方法 采用SPSS Ver10.00统计软件进行两组间比较t检验，以P
3.实验结果
3.1实验动物数量分析 纳入实验观察的大鼠共68只，共分5组，正常组12只，模型组及给药各组分别14只。在给药治疗阶段，大鼠死亡情况：DN模型组死亡3只；中药预防组死亡2只；中药治疗组低剂量组死亡3只；高剂量组死亡2只。纳入结果分析58只。
3.2血糖和尿微量白蛋白 治疗前造模各组大鼠血糖和尿微量白蛋白与正常组比较，均明显升高(P＜0.01)，而造模各组间血糖和尿微量白蛋白未见明显差异(P>0.05)。中药各组治疗后比治疗前血糖和尿微量白蛋白均有降低，(P
3.3肾小球滤过率 造模各组大鼠肾小球滤过率均明显高于正常组(P
3.4血栓素(TXB2)6-酮前列腺素(6-keto-PGF)
中药各组治疗后TXB2和T/K比模型组显著降低(P0.05)，见表4。
3.5RT-PCR法检测各组大鼠肾皮质PDGF-B mRNA表达 结果显示模型组及中药各组PDGF-BmlLNA表达均明显高于正常组，中药各组治疗后PDGF-B mRNA表达均明显低于模型组，但中药高剂量组与中药预防组组间差异无统计学意义，见表5。
4.讨论
DN是消渴病病久而继发之病，从DM到DN的病程中，始终存在脏腑柔弱，随之出现气阴两虚，而运化失职，气化失司，形成湿浊、瘀血、痰饮等实邪阻滞，形成了DN本虚标实的病机特征。中医总体治则是平衡阴阳，扶正祛邪。
本方组成特点：①益气养阴，健脾益肾：DN早期以气虚为关键，病变在脾肾，同时气阴两虚是DM和DN的根本病机，故用益气养阴、健脾益肾法是抑制病机进展、截断DM向DN转化的关键。②活血化瘀、祛痰利湿：痰浊血瘀是DN发生与加重的重要病理因素，并贯穿于DN的始终，故需兼用祛瘀化浊之法。本方中益气养阴的药物主要通过降低DN的血糖，间接参与血流动力学调节，活血化瘀药物可直接作用于血管，改善肾脏内微循环。
肾小球滤过率是反映肾脏血流动力学的敏感指标，肾脏血流动力学的变化是导致DN发生发展的主要因素，甚至可能是启动因素。肾小球高滤过是导致DN发生中功能与形态学改变的基础。但目前引起DN早期肾脏高滤过的机制尚未完全阐明，考虑与高血糖密切相关，高血糖可引起肾小球高滤过、高内压和血流动力学改变，导致肾小球硬化，并与前列腺素、肾素-血管紧张素系统等有关。DN滤过率增加的主要原因是由于肾内血管阻力降低，尤其是人球小动脉的阻力比出球小动脉的阻力下降更为明显，使肾血浆流量增加，肾小球滤过压增加，导致肾小球高滤过。肾小球高灌注、高滤过，使肾小球内毛细血管切流压增加，引起血管内皮和上皮细胞损害，破坏正常滤过屏障，随之发生血管内皮细胞形态和功能改变，出现尿蛋白，导致肾功能损害。本方有效降低高滤过、UAIB，对防治DN有重要意义。抗血小板聚集，改善肾内微循环。DN早期常存在肾小球血液动力学异常，而肾小球血液动力学异常是导致蛋白尿的一个重要因素。DN存在明显的血小板功能亢进，血中TXA2含量增高导致血小板聚集和血管收缩增强，血小板生长因子释放，刺激血管平滑肌、结缔组织增生，血液黏稠度增加，微血栓形成，加重肾脏的缺血缺氧，血管通透性增强，可导致尿蛋白漏出，加速肾病的发展。目前认为，血浆TXA2/PGI2比例失衡在DN微血管病变的发生发展中可能起重要作用。
目前国内外均以测定TXB2和6－k－PGF作为判定TXA2和PGI2的指标，有研究表明，糖尿病患者血浆TXB2明显增高，6-k-PGF明显降低。DM在未出现血管病变时，TXB2已高于正常，6k-PGF下降，TXB2/6-k-PGF升高，表明血小板功能增强，TXA2释放增多，易引起血管并发症。
DN微血管病变时，其血栓素增高，血小板功能亢进，血管收缩，血小板聚集，血液高凝，血流缓慢，以致血流在血管内中断。此皆为中医痰凝血滞脉道之变，治当活血化瘀。现代研究表明，活血化瘀药具有改善微循环、抑制血小板聚集、降低血液黏度的作用。据报道大黄可以改善血液流变学异常，部分药物虽无活血功能，但药理证明对血液流变学也有作用。如黄芪、大黄、丹参均有扩张血管，纠正血流动力学异常，减少尿蛋白的作用。
本实验结果显示中药各组与模型组相比，其血浆TXB2-水平明显下降；6-k-PGF水平升高；TXB2/6-k-PGF下降。本实验结果证实了瘀血在DN发病中的重要性，微循环障碍是造成血瘀的直接原因，而瘀血这一病理产物又是造成病情进展的重要因素。表明本方有较好的调节血小板功能的作用，抑制血小板的黏附聚集，改善肾内微循环，调整肾小球滤过功能，延缓DN发生发展。本实验研究PDGF-B基因在肾组织的表达，旨在从细胞因子、基因水平探讨本中药复方防治早期DN的药理机制，寻求防治DN更有效的方法。 PDGF是广泛存在于人体内的细胞生长因子，PDGF可由血小板、单核/巨噬细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、肾小球系膜细胞以及纤维母细胞等产生。PDGF是参与成纤维细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞等增殖的生长因子，具有成纤维细胞、单核细胞、粒细胞的趋化性和促有丝分裂的性能，可促进结缔组织的生长并产生ECM。在高糖下，系膜细胞产生PDGF、TGF-β1、PGs等因子增加，参与DN的发生与进展。PDGF多肽类生长因子中对系膜细胞促有丝分裂作用最强的一种，并可诱发血管收缩和舒张，参与肾小球血液动力学改变，此外又能通过影响TGF-β、前列腺素间接促进系膜细胞外基质产生和系膜细胞有丝分裂效应。 本研究结果表明造模各组大鼠PDGF-β基因水平均高于正常组，与国内外报道一致。中药组治疗后PDGF-B基因表达均明显低于模型组，减缓肾小球毛细血管内压增高及系膜区基质堆积和基底膜增厚，减轻和延缓DN进展。故推测本方抑制PDGF-B基因的过度表达可能是早期DN防治的重要机制之一。