益肾壮骨颗粒剂对人工关节生物因素松动的影响

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（1.杭州市中医院，浙江 杭州 310007；2.平湖市中医院，浙江 平湖 314200）

摘 要：目的： 探讨益肾壮骨颗粒剂对人工关节生物因素松动的影响。方法：随机选择准备行人工髋关节置换术患者20例。采集外周血，分离单个核细胞，每例标本分成5份。A组：仅单个核细胞，为正常对照组；B组：单个核细胞+骨水泥微粒，为模型组；C组：单个核细胞+骨水泥微粒+益肾壮骨低剂量组（3mg・mL-1）；D组：单个核细胞+骨水泥微粒+益肾壮骨中剂量组（6mg・mL-1）；E组：单个核细胞+骨水泥微粒+益肾壮骨高剂量组（12mg・mL-1）。培养48 h后，用ELISA测定细胞上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）含量。结果：模型组的TNF-α和IL-6含量均明显高于正常对照组（P

关键词：益肾壮骨颗粒剂；人工关节；假体失效；骨溶解

中图分类号：R318.17文献标识码：A文章编号：1673-7717（2011）03-0520-03

TheCytokine Study of Yishenzhuanggu'sEffect on the Artificial Joint Loosening

CHENG Yi1, CHEN Jun-bo2 , HUANG Hai,ZHU Hang1,ZHANG Yu-ming1

（1.Hangzhou Hospital of TCM , Hangzhou 310007,Zhejiang,China；

2.Pinghu Hospital of TCM,Pinghu 314200,Zhejiang,China）

Abstract:Objective:To explore the effects ofYiShenZhuangGu on aseptic cytokine of loosening of prothesis in vitro. Methods:From 20 patients，blood sample were taken, whose mononuclear cells were isolate and then divided into five groups.Group A:only mononuclear cells, which was control group;group B:mononuclear cells + Poly methyl methacrylate particles;Group C:mononuclear cells + Poly methyl methacrylate particles + YiShenZhuangGu （3mg・mL-1）;Group D:mononuclear cells + Poly methyl methacrylate particles + YiShenZhuangGu （6mg・mL-1）;Group E:mononuclear cells + Poly methyl methacrylateparticles + YiShenZhuangGu （12mg・mL-1）.They were cultured for 48 hours, and the a mount of osteolytic factors such as TNF-a and IL-6 of each group was determined. Results: The levels of TNF-α and IL-6 were much higher in group B than A, C, D and E（P

Key words:YiShenZhuangGu；Prosthesis；Prothesis failure；Osteolysis

收稿日期：2010-10-06

基金项目：浙江省中医药科技计划资助项目（2006C102）；杭州市科技计划资助项目（20070433Q27）

作者简介：成羿（1957-），男，浙江杭州人，主任医师，硕士研究生导师，研究方向：骨关节疾病和颈腰椎疾病。

目前，人工髋关节和人工膝关节置换术，被认为是效果非常肯定的治疗方法。而假体植入后松动给许多行关节置换术病人带来了极大的身心痛苦，给社会和家属带来了巨大的经济负担，因此有效地解决这一问题具有重大的社会效益和经济效益。人工关节无菌性松动的原因归纳为两大主要因素：一为机械因素，即微动引发松动；另一因素是生物因素，即微粒引发松动。近年来，许多作者通过实验研究提出多种人工关节磨损颗粒，在骨-骨水泥或骨-假体界面组织中引起的慢性异物炎症反应是造成骨溶解的根本原因［1］。在骨溶解过程中，溶骨性细胞因子对破骨细胞起着重要的调节作用。这些溶骨性细胞因子主要包括肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素（IL-6）等。作者在以往研究益肾壮骨颗粒剂防治骨质疏松中发现，该中成药具有抑制骨吸收作用［2］，因此本研究通过单个核细胞、骨水泥和益肾壮骨颗粒剂混合培养，间接探讨益肾壮骨颗粒剂防治因微粒引发的人工关节生物因素性松动的可能性。

1 材料和方法

1.1 样本采集 随机选择股骨颈骨折患者准备行人工髋关节置换术20例。其中男11例，女9例。平均年龄51（40～69）岁。每例患者采集外周血10 ml，肝素抗凝。

1.2 主要试剂和器材 益肾壮骨颗粒剂（杭州市中医院制备）；未聚合的骨水泥粉末（美国Zimmer公司制造，微粒直径为2～3μm）；HANK'S液（杭州宏博生物制品公司）；胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）；RPMI1640溶液（吉诺生物医药技术有限公司）；FICOLL分离液（上海恒信化学试剂有限公司）；台盼蓝（中国医药集团上海化学试剂公司）；6孔培养板（美国FALCON公司）；TNF-（和IL-6试剂盒（美国MARKETINC公司）；CO2组织培养箱（美国Heraeus公司）；电热恒温水浴箱（上海医用恒温设备厂）。

1.3 实验方法 无菌采集准备行人工髋关节置换术患者外周血10mL，用肝素抗凝。抗凝血以HANK'S液稀释一倍后，用FICOLL分离液梯度离心法分离出单个核细胞。洗涤3次，加含10%小牛血清的RPMI1640培养液制成细胞悬液，细胞记数，调整细胞至4×105 mL-1。台盼蓝排除法检测细胞活力；向6孔培养板中滴加细胞悬液，每孔加3mL，最后一孔空置。置37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱培育4h，使细胞贴壁，利用单个核细胞的贴壁性，洗去非贴壁细胞，留下单个核细胞。每板第1孔加入含10%小牛血清的RPMI1640培养液3mL，余4孔中加入含10mg・mL-1骨水泥的RPMI1640培养液3mL，并于第3、第4和第5孔中分别加入9、18、36mg益肾壮骨颗粒剂，使其浓度分别为3、6、12mg・mL-1。即第一孔为仅有单个核细胞的正常对照组，第2孔为单个核细胞+骨水泥的模型组，第3孔为单个核细胞+骨水泥+益肾壮骨颗粒低剂量组（3mg・mL-1），第4孔为单个核细胞+骨水泥+益肾壮骨颗粒中剂量组（6mg・mL-1），第5孔为单个核细胞+骨水泥+益肾壮骨颗粒高剂量组（12mg・mL-1）。混匀，同条件培养48 h，取上清液，水平离心机以1500r/min×10min离心。ELISA测定细胞上清液中肿瘤坏死因子TNF-α含量和白细胞介素IL-6含量。

1.4 数据处理 数据以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析q检验法检测不同处理组之间TNF-α和IL-6含量的差异有无统计学意义。

2 结 果

2.1 TNF-α含量测定结果 见表1。

表1 五组不同处理组TNF-α的含量（±s）

注：与正常对照组比较，ΔP

方差分析提示：模型组（单个核细胞+骨水泥）TNF-α含量高于正常对照组（P

2.2 IL-6含量测定结果 见表2。

表2 5组不同处理组IL-6的含量（±s）

注：与正常对照组比较，ΔP

方差分析提示：模型组的IL-6含量高于正常对照组（P

3 讨 论

人工关节置换历经30年的发展和改进，长期保留了病变关节的功能，明显提高了患者的工作能力和生活质量。随着人工关节使用年限的延长，人工关节无菌性松动这一问题逐渐显得重要起来，虽然随着第二、三代骨水泥技术和生物式固定技术的发展，人工关节无菌性松动的发生率有所下降，但这一问题仍未得到彻底解决，而且已成为人工关节置换术远期失败的最主要原因，并严重影响了人工关节的发展和推广运用。大多学者认为，磨损微粒诱导破骨细胞性骨溶解是人工关节松动的关键。不同的假体材料产生不同的磨损微粒，主要有：骨水泥微粒（PMMA）、超高分子量聚乙烯微粒（UHMWPE）、钛合金微粒（Ti-6Al-4V）和钴铬合金微粒（CoCr）。其过程是：假体磨损产生磨损微粒，刺激巨噬细胞释放多种细胞因子（TNF-α，IL-6等），其中TNF-α与无菌性松动的关系最为密切。这些细胞因子通过多种途径产生一系列生物反应，最终导致骨吸收和人工关节松动。

二膦酸盐能抑制骨吸收，并在骨质疏松症的治疗中取得成功。因此，有学者尝试用二膦酸盐来治疗微粒引起的假体松动。1995年Pennanen等［3］将二磷酸盐加入巨噬细胞raw264培养液中，经过培养后，发现二磷酸盐能明显抑制巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6等溶骨性因子。范卫民等［4］也认为二磷酸盐可明显抑制TNF-α的分泌，从而抑制骨溶解，防治人工关节无菌性松动。益肾壮骨颗粒剂在我们以往研究防治骨质疏松中发现［2］，该药具有抑制骨吸收作用，骨组织形态剂量学检测显示，治疗组的破骨细胞数和骨吸收陷窝数显著低于模型组；且益肾壮骨颗粒剂具有整体调治作用，即该药同时具有促进成骨、抑制破骨、加速骨矿化等作用。本实验我们又从细胞因子学角度探讨益肾壮骨颗粒剂防治假体松动的可能性。

单个核细胞与巨噬细胞为同一来源，在功能上有相同之处，很多学者［4］以单个核细胞代替巨噬细胞进行人工关节无菌性松动的病因研究。本研究通过人体外周血单个核细胞与骨水泥混合培养发现，骨水泥微粒可刺激单个核细胞分泌大量的TNF-α和IL-6，再次说明微粒在人工关节无菌性松动中起着重要作用，但当单个核细胞+骨水泥微粒+益肾壮骨颗粒剂混合培养48h，结果发现上清液中的TNF-α和IL-6含量下降，说明益肾壮骨颗粒剂能有效抑制单个核细胞分泌TNF-α和IL-6等溶骨性因子，抑制这些溶骨性因子引起的破骨细胞介导的骨溶解，从而能够减缓人工关节无菌性松动的发展过程。

其他一些学者的研究也证实了补肾中药可抑制TNF-α和IL-6的分泌。周丕琪等［5］运用补肾中药进行临床观察，认为经过补肾中药治疗后血清IL-6及TNF-α的水平下降，说明补肾中药能抑制IL-6和TNF-α骨吸收因子产生，通过干扰IL-6和TNF-α细胞因子的分泌，减少破骨细胞性骨吸收。夏远军等［6］认为经补肾中药治疗可显著降低TNF-α水平，提示补肾中药可以降低TNF-α的水平。他们通过斑点杂交技术及原位杂交技术进行研究发现模型组大鼠IL-6mRNA表达较正常对照组明显升高，而运用补肾中药治疗组的大鼠IL-6mRNA表达则较模型组明显下降。

同时本实验以3、6、12mg・mL-13种不同浓度的益肾壮骨颗粒剂观察其对单个核细胞分泌TNF-α和IL-6的抑制作用，结果发现，虽然3组之间的差异无统计学意义，但可以提示，随着益肾壮骨颗粒剂浓度的增高，单个核细胞分泌TNF-α和IL-6的量逐渐减少，进一步说明益肾壮骨颗粒剂可明显抑制单个核细胞分泌TNF-α和IL-6等溶骨性因子，从而益肾壮骨颗粒剂对人工关节生物因素松动方面有一定的防治作用。目前国内外患者对天然药物需求日益扩大，中医药治疗多靶点、有效低毒的特点无疑具有良好的开发和推广前景，当然，本实验仅是体外的初步研究，还有待进一步的动物实验和临床研究证实。

参考文献

［1］ 范卫民,王青,陶松年,等.人工关节松动病因的研究［J］.中华骨科杂志, 1998, 18（9）:518-521.

［2］ 成羿, 朱杭, 黄海, 等. 益肾壮骨颗粒剂配合钙剂防治雄性大鼠去睾后骨丢失的组织形态计量学研究［J］. 中医正骨, 2000,12（12）:711-714.

［3］ Pennanen N, Lapinjoki S, Urtti A, et al.Effect of liposomal and Biphosphonates on the IL-1 beta.IL-6 and TNF alpha secretion from RAW 264 cells invitro［J］.Pharm Res, 2000,12:916-920.

［4］ 范卫民, 马益民, 王青, 等. 二磷酸盐对人工关节松动影响的实验研究［J］. 江苏医药杂志, 2000,26（8）:615-617.

［5］ 周丕琪, 沈霖, 杜靖远, 等.补肾法对绝经后骨质疏松症患者IL-6、TNF-α的影响［J］.中国中医骨伤杂志,2000,8（4）: 1-3.

［6］ 夏远军, 沈霖. 补肾法治疗骨质疏松的分子机制［J］.中国中医骨伤杂志,2004, 12（4）: 53-55.