十全大补汤对Lewis肺癌小鼠MMP-9基因表达的影响

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摘 要：目的：探讨十全大补汤对lewis肺癌组织中MMP-9基因表达的影响。方法：50只小鼠采用细胞株接种的方法复制Lewis肺癌转移模型，造模成功后，将小鼠分为模型组，CTX组，十全大补汤低、中、高剂量组。采用RT-PCR方法检测十全大补汤对 Lewis肺癌组织中mmp-9基因表达的影响。结果：十全大补汤中、高剂量组的肿瘤转移抑制率为43.20%、29.59%，两组中MMP-9的表达下降，与模型组比较有统计学意义（P＜001）。结论：十全大补汤下调MMP-9基因表达是其抑制肺癌转移的分子机制之一。

关键词：肺癌；十全大补汤；基质金属蛋白酶-9

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2767-03

Effect of Shiquan Dabu Decoction on MMP-9 gene

Espression in Lewis Lung Cancer Mice

SUN Daxing1，ZHANG Yongjun2, BAO Wenlong2

(1.Zhejiang Tonglide Hospital, Hangzhou 310012,Zhejiang,China;

2.Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou 310022,Zhejiang,China)

Abstract:Objective: To study the effect of Shiquan Dabu Decoction on MMP-9 gene expression in Lewis lung cancer mice. Methods: The 50 mice were randomly divided into 5 groups: the model group, the Cyclophosphamide group, the low、middle and high dosage groups of Shiquan Dabu Decoction after the cancerometastasis mice model of Lewis lung cancer were established by inoculating tumor cell. The gene expression of MMP-9 in tumour tissues were detected by reverse-transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). Results: The tumor metastasis inhibition rate in the middle and high dosage groups of Shiquan Dabu Decoction were 43.20% and 29.59% respectively. Moreover, the contents of MMP-9 genes,compared with model group, were decreased (P＜0.01). Conclusion: Reducing gene expression of MMP-9 was one of molecular mechanism of Shiquan Dabu Decoction inhibiting lung cancer’s metastasis.

Key words:lung cancer; Shiquan Dabu Decoction; matrix metalloproteinases-9

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收稿日期：2011-07-22

作者简介：孙大兴（1958-），男，浙江绍兴人，主任医师，硕士研究生导师，研究方向：中西医结合肿瘤临床。祖国医学认为，肺癌自始至终表现为一系列正气为癌毒所耗散的证候，癌毒的发生与发展均本于正虚，且随着病情进展，正气不断耗散，导致其外抗和内固癌毒的能力下解，进而发生癌毒的扩散。据此，我们选用经典的扶正固本方剂—十全大补汤进行抗肿瘤转移的研究，并对其作用机理作一初探，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及瘤株

C57BL/6小鼠50只，体重（20±2）g，鼠龄4周，雌雄各半。购于上海医学科学院实验动物中心。小鼠Lewis肺癌瘤株，购于上海医学科学院实验动物中心。瘤株于浙江中医药大学动物中心进行传代。

1.2 药物

十全大补汤：黄芪12g,肉桂3g,人参6g,茯苓9g,白术9g,甘草3g,熟地12g,白芍9g,川芎6g,当归9g（《方剂学》第6版上海科技出版社）。药材购自浙江中医药大学门诊部中药房，药品质量符合《中华人民共和国药典》标准（2005年版）。按常规方法煎成汤剂，配制成低、中、高剂量，其生药含量分别为0.4、0.8、1.6g/mL。4℃冰箱保存备用。注射用环磷酰胺（CTX）：0.2g/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号为04041421，生理盐水配制成5mg/mL稀释液，4℃冰箱保存备用。

1.3 试剂及仪器

RT-PCR试剂盒、DNA Marke、琼脂糖购于上海捷兰生物科技有限公司。TGL-16B台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂；2400型PCR仪，英国TECHNE公司产品；DY-501B型电泳仪，上海琪特分析仪器有限公司；H6-1微型电泳槽，上海琪特分析仪器有限公司；GIS-2008凝胶成像系统，上海天能科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 造模方法 取传代13天的Lewis肺癌瘤株，匀浆，制成单细胞悬液，无菌生理盐水调整细胞浓度至1×107个/ mL（台盼蓝染色实验示活细胞数大于95%）。每只02mL,接种于小鼠右腋皮下，复制小鼠Lewis肺癌转移模型。

1.4.2 动物分组 造模24h后，将小鼠随机分为5组（根据随机数字表进行分组）：模型组，CTX组，十全大补汤低、中、高剂量组，每组10只。

1.4.3 动物给药 分组当天起开始用药，具体给药方法如下：模型组小鼠灌服生理盐水，剂量为0.2mL/10g；CTX组小鼠腹腔注射CTX，剂量为每10g体重0.5mg药物（0.5mg /10g，下同）；十全大补汤低、中、高剂量组小鼠分别灌服低、中、高剂量十全大补汤，剂量分别为0.08、0.16、0.32g/10g。每日1次，连续15天。第16天，称体重，脱颈椎处死小鼠。取肺组织，计数肺内转移灶数目（取全肺，用Bouin氏液固定24h，然后用无水乙醇漂洗至黄色褪去，转移灶呈白色小点）。剥取肿瘤组织，液氮保存。

1.5 检测指标

1.5.1 小鼠整体状态的变化 观察小鼠的体重变化、饮食、行动、精神食欲、行动状态、毛色、皮毛的光泽度等全身情况。

1.5.2 抗转移率 公式为：（1-用药组平均肺转移结节数∕模型组平均肺转移结节数）×100％。

1.5.3 肺癌组织中MMP-9基因的表达 （1）总RNA抽提：采用异硫氰酸胍—酚—氯仿一步法提取。

（2）逆转录反应：按照试剂盒说明进行。

（3）PCR引物：MMP-9(Gene bank accession NO.BC046991)，上游引物：5’-CTG GTC ATA AGG GCT AAA T-3’，下游引物：3’-TCT TGG CGT CAC TTC TCA-3’，上下引物间距为199bp。内参基因为GAPDH (Gene bank accession NO.BC083149)，上游引物：5’-TAC TAG ACA AGA TGG TGA AG-5’，下游引物：5’-TGA CGG GAT CTC GTC CCT GGA AGA T-3’，上下引物间距为255bp。（引物由上海生工生物工程打桩服务有限公司合成）。

（4）PCR扩增：PCR反应体系总体积为25.8μL：去离子水18.0μL、10×buffer2.5 μL、Mgcl21.5μL、dNTP（10mM/each）0.5μL、Primer（up 50pM/μL）1.0 μL、Primer（down 50pM/μL）1.0 μL、Taq（5U/μL）0.3 μL、Template（即cDNA）1.0 μL。

（5）温度条件：GAPDH温度条件：95℃ 5min、94℃ 30s、508℃ 30s、72℃ 30s、72℃ 10min、4℃保存。其中94℃，508℃，72℃3个步骤持续33个循环。MMP-9温度条件：95℃ 5min、94℃ 30s、54℃ 30s、72℃ 30s、72℃ 10min、4℃保存。其中94℃，54℃，72℃3个步骤持续33个循环。

（6）电泳：1.7%琼脂糖凝胶，110V电压电泳40min，紫外凝胶成像系统分析电泳产物，以在细胞中表达稳定的GAPDH基因为内参，用目的基因的光密度与GAPDH光密度的比值为半定量分析数据。

1.6 统计学方法

采用统计软件包SPSS 11.5版统计，数值用均数±标准差（±s）表示。

2 结 果

2.1 成功建立小鼠Lewis肺癌转移模型

实验过程中，小鼠均于接种后第4~7天右腋下出现大小不等的肿块。第16天处死小鼠，镜下可见各组小鼠肺组织都出现不同数目的转移灶。提示小鼠Lewis肺癌转移模型复制成功。

2.2 十全大补汤对小鼠整体情况的影响及对肺癌转移的抑制作用

CTX组小鼠逐渐出现拱背、喜静，行动迟缓，毛发不荣，饮水饮食减少，体重增加缓慢等表现。其余4组小鼠行动较灵活，毛发光泽度好，体重增加较快，尤以十全大补汤中剂量组明显。实验发现各组小鼠肺内均出现大小、数量不等的转移灶。与模型组比较，中药低、中、高剂量组及CTX组肺内转移结节的数目明显减少，有显著统计学差异（P＜0.01）见表1。

2.3 十全大补汤对小鼠Lewis肺癌组织中MMP－9 mRNA表达的影响

与模型组比较，CTX组及中药中、高剂量组小鼠肿瘤组织中MMP－9mRNA表达明显降低，有显著统计学意义（P＜0.01）。详见表2。

注：与模型组比较，P＜0.01；与CTX组比较,P＜001。

3 讨 论

肿瘤转移的主要原因为正气内虚、伏邪未尽、血瘀痰凝等，其中正气内虚是肿瘤转移的根本原因，余毒未尽是转移发生的关键因素\[1\]。正虚失于固摄，则使癌毒易于扩散，而癌毒又耗散正气，加重正虚。因此，增强正气可延缓或抑制癌毒的转移。十全大补汤出自《太平惠民和剂局方》，由八珍汤加黄芪、肉桂组成，主治“诸虚不足”，是经典的扶正培本古方。方中黄芪补气升阳，益卫固表，肉桂补火助阳，温经通脉，人参、白术、茯苓、甘草补脾益气，当归、芍药、地黄滋养心肝，川芎入血分而理气，归、地补而不滞。组方配伍颇符合癌毒转移的病机。实验结果也验证辨证论治的正确性：十全大补汤具有抑制肿瘤转移的作用，尤以中剂量作用明显，其转移抑制率达43.20%。本实验结果证明扶正固本中药具有一定的抗肿瘤转移作用。根据这一结果，我们考虑，当患者手术、放化疗结束后，正气受到损伤时，采用补益类中药进行维持治疗或可延缓、防止肺癌的复发及转移，达到延长生命或根治肿瘤的目的。下一阶段，我们拟采用随机单肓的方法进行临床验证。

明确十全大补汤具有抑制肿瘤转移的作用同时，我们选择与肿瘤转移密切相关的MMP-9基因进行作用机理的研究。目前认为，肿瘤的浸润和转移是肿瘤细胞与肿瘤基质成分共同参与的过程，其基本过程为肿瘤细胞从原发瘤脱离后向周围和(或)远处组织侵袭和转移,这一过程涉及瘤细胞穿过细胞外基质(extracelluarma- trix,ECM)屏障、血管壁的基底膜及穿出血管壁进入宿主微环境等\[2\]。肿瘤细胞发生浸润和转移时,需要其表面的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)对相邻组织细胞外基质的降解作用,才可能穿透组织细胞的基底膜和血管到达较远的组织部位。因此，瘤细胞侵袭转移能力与其诱导产生蛋白酶降解ECM、基底膜的能力密切相关\[3\]。而MMPs(明胶酶B/92k DaⅣ型胶原酶)正是肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶中降解Ⅳ型胶原最主要的酶,其在肿瘤的血管化、肿瘤细胞的浸润和转移灶的形成过程中起重要作用\[4-5\]。它广泛参与肿瘤细胞生物学行为的调节，从而在肿瘤发生发展的各个阶段均发挥重要的作用\[6\]。研究发现，MMP－9与肺癌细胞分化程度负相关，与TNM（nm-classification tumor, nodes,metastasis-classification,恶性肿瘤国际临床病期分类）分期正相关，生存期小于2年者的MMP－9阳性表达率显著高于生存期大于或等于2年者，且其阳性表达上调与肺癌转移相关\[7\]。

本实验结果示模型组MMP-9表达最高（达1.75±023），小鼠肺内转移灶的数目也最多（16.90±2.02 ），明显高于其余4组。而经十全大补汤治疗后，随着MMP-9表达的下降，小鼠肺内转移灶的数目也相应减少。实验在证明MMP-9的表达强度与淋巴结转移显著相关的同时\[8\]，也提示十全大补汤抑制肿瘤转移的作用与抑制MMP-9基因表达有关。

综上分析［9-21］，实验结果提示十全大补汤具有抑制肺癌转移的作用，其作用机制之一是抑制MMP－9 mRNA在肿瘤组织中的表达，减少MMP-9对ECM的降解作用，进而阻断肿瘤细胞进入血管的通路，达到抑制肺癌远处转移的作用。另外，肿瘤转移包含复杂的分子机制，许多黏附分子、蛋白溶酶、细胞因子和生长因子参与了这一过程\[9\]。抑制MMP-9基因的表达只是十全大补汤抑制肺癌转移的机制之一，是否还存在其它分子机制有待进一步研究。

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