艾叶总黄酮的提取及纯化工艺条件
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摘要：以总黄酮的吸附率、解吸率为指标，采用可见分光光度计测定总黄酮的含量，考察ＡＢ－８型大孔吸附树脂对艾叶总黄酮的最佳纯化条件。结果表明，最佳吸附条件为样液浓度０．３１１ ｍｇ／ｍＬ，吸附速率１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，样液ｐＨ值２，上样量每克大孔树脂５ ｍｇ粗黄酮溶液；最佳解吸条件是４倍床体积、体积分数为７０％的乙醇，以１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的速率洗脱。艾叶总黄酮的含量（质量分数）在未经纯化之前为１９．３％，在最佳条件下纯化之后可达６０．１％，约是原来含量的３．１倍。
中图分类号：Ｑ９４９．７８３．５；Ｒ２８４．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）12－2519-03
Study on the Extracting and Purifying Conditions of Total Flavonoids from Argy Wormwood Leaves
ＳＨＥＮ Ｘｉａｎｇ－ｚｈｏｎｇ
（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｕｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎｉｔｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｏｕｄｉ ４１７０００，Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ａｒｇｙ ｗｏｒｍｗｏｏｄ ｌｅａｖｅｓ ｂｙ ＡＢ－８ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ａｎｄ ｅｌｕｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｓ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｃｒｉｔｅｒｉａ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙＶｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ， ０．３１１ ｍｇ／ｍＬ； ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒａｔｅ， １．０ ｍＬ／ｍｉｎ； ｐＨ， ２； ５ ｍｇ ｃｒｕｄｅ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｐｅｒ １ ｇ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎ． Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ４ＢＶ， ７０％（V/V） ａｌｃｏｈｏｌ ａｔ ａ ｒａｔｅ ｏｆ １．０ ｍＬ／ｍｉｎ． Ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｏ ６０．１％， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ３．１ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈａｔ ｕｎｐｕｒｉｆｉｅｄ（１９．３％）．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｇｙ ｗｏｒｍｗｏｏｄ ｌｅａｖｅｓ；ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
总黄酮广泛存在于自然界的某些植物和果浆中，总数大约有４千多种，其分子结构不尽相同，如芸香苷、橘皮苷、栎素、绿茶多酚、花色糖苷、花色苷酸等都属总黄酮。总黄酮的功能是多方面的，它具有消除氧自由基、抗氧化、调节血脂、抗肿瘤、抗病毒等生理活性，同时总黄酮具有抗溃疡、抗过敏、抗菌、抗炎、抗衰老、降血脂、治疗心脑血管疾病等药用保健功能，是一类具有广阔开发前景的天然抗氧化剂［１－７］。另外，在食品工业上可作色素用［６］。
生物类黄酮（Ｂｉｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ）亦称维生素Ｐ，常与维生素Ｃ伴存，在自然界分布广泛，属植物次级代谢产物，是一组存在于蔬菜、水果、花和谷物中的天然色素，因多呈黄色而称生物类黄酮。大孔吸附树脂物理化学稳定性高、吸附选择性独特、不受有机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等，广泛用于生化和天然物质的分离提纯［8，9］。郑亚杰等［１0－１5］的研究表明，ＡＢ－８型大孔吸附树脂对总黄酮有较好的吸附效果。试验主要研究用ＡＢ－８型大孔吸附树脂纯化艾叶总黄酮的最佳工艺条件，其中考虑的主要因素是样液浓度、吸附速率、样液ｐＨ值、上样量对吸附率的影响，洗脱剂体积分数、洗脱速率、洗脱剂用量对解吸率的影响。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１仪器ＦＡ２００４型电子天平；１０１－２ＡＢ型电热鼓风干燥箱；ＲＥ－５２Ｄ旋转蒸发器；ＷＦＪ７２００型可见分光光度计；玻璃层析柱（１５ ｍｍ×２００ ｍｍ）；ｐＨＳ－３Ｃ数字酸度计；ＳＨＺ－Ｄ循环水式真空泵。
１．１．２药品艾叶（购于娄底药店）；ＡＢ－８型大孔吸附树脂（天津市光复精细化工研究所）；芦丁（上海化学试剂公司）；氢氧化钠；亚硝酸钠；硝酸铝；盐酸；无水乙醇；体积分数为９５％的乙醇；石油醚；乙醚。以上试剂均为分析纯。
１．２方法
１．２．１粗黄酮的提取取一定量的艾叶，将其洗净，把水晾干，然后放入干燥箱中，在５０ ℃下烘干。再用粉碎机将其磨成碎末。称取一定量的艾叶碎末按以下方法脱色和脱脂。以无水乙醚为脱脂剂，在４５ ℃水浴下脱脂约２０ ｈ，充分除去样品中脂类和脂溶性色素，当用玻璃棒蘸一滴刚要发生虹吸时的浸提液于滤纸上，而滤纸上没有油斑，可认为脱脂完全，再放入干燥箱中５０℃烘干。将脱过脂的样品放入圆底烧瓶中，加入体积分数为７０％的乙醇溶液，回流浸提８次，每次２ ｈ左右，且前４次样品的质量（ｇ）与乙醇的体积（ｍＬ）比为１∶８，后４次为１∶６，最后一次浸提液几乎无色，说明浸提基本完成。合并８次浸提液，放入分液漏斗中，用石油醚进行二次脱脂，收集二次脱脂过的粗黄酮提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至一定体积，再放入真空干燥箱中干燥得到粗黄酮粉末。
１．２．２标准曲线的建立精密称取芦丁对照品５０．３ ｍｇ置于１００ ｍＬ容量瓶中，加体积分数为６０％的乙醇溶解，定容至刻度。精密吸取该溶液５０ ｍＬ于１００ ｍＬ容量瓶中，定容至刻度，得浓度为０．２５２ ｍｇ／ｍＬ的芦丁对照品溶液。分别精密吸取该芦丁对照品溶液０．０、２．０、５．０、８．０、１２．０、１６．０ ｍＬ于５０ ｍＬ容量瓶中，各加体积分数为３０％的乙醇４ ｍＬ，６ g/L亚硝酸钠２ ｍＬ，放置６ ｍｉｎ后加１０ g/L硝酸铝溶液２ ｍＬ，同样放置６ ｍｉｎ后加入１０ g/L氢氧化钠溶液２０ ｍＬ，补加３０％乙醇至５０ ｍＬ，放置１５ ｍｉｎ。用分光光度计于５０８ ｎｍ波长处测定吸光度，由此可作出标准曲线，并计算出线性回归方程。
由标准曲线可以计算得回归方程为Ａ＝９．９７８ ８Ｃ＋０．０１１ ８，其中Ｃ为芦丁对照品溶液的浓度（ｍｇ／ｍＬ），相关系数ｒ＝０．９９８ ９。
１．２．３ＡＢ－８型大孔吸附树脂的预处理称取约１６ｇ的ＡＢ－８型大孔吸附树脂按照以下步骤对其进行处理。先用９５％的乙醇充分浸泡２４ ｈ后装柱，然后用９５％的乙醇洗至加适量水无白色浑浊，再用去离子水洗至无醇味后加入大约４倍床体积的体积分数为５％的ＨＣｌ浸泡３～４ ｈ，用去离子水洗至中性，再加入大约４倍床体积的为５ g/L的ＮａＯＨ溶液浸泡３～４ ｈ，最后用去离子水洗至中性即可使用。
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１．２．４粗黄酮中总黄酮含量的测定称取３２．７ ｍｇ的粗黄酮，在９０ ℃用去离子水溶解，然后用离心机３ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心，取上层清液配成５０ ｍＬ溶液，再取１０ ｍＬ该溶液于５０ ｍＬ容量瓶中，按步骤１．２．２的方法测得总黄酮含量为１９．３％。
２结果与分析
２．１样液浓度对吸附率的影响
称取６５７．１ ｍｇ粗黄酮在９０ ℃水浴中用去离子水溶解，３ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心后取上层清液配成２５０ ｍＬ溶液，均分成５份，再分别稀释至浓度为０．０６６、０．２１７、０．３１１、０．４１３、０．５０７ ｍｇ／ｍＬ的溶液。然后将它们均以１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的速率过柱，分别用３倍床体积的水洗柱，收集吸附及洗柱流出液，按步骤１．２．２的方法测量其中的总黄酮含量，据此计算出不同样液浓度下的吸附率（图２）。由图２可以看出，当样液浓度小于０．３１１ ｍｇ／ｍＬ时，随着样液浓度的增大，吸附率也增大；当样液浓度为０．３１１ ｍｇ／ｍＬ时，吸附率达到最大值，随后随着样液浓度的增大，吸附率减小。所以，上样时应使样液浓度为０．３１１ ｍｇ／ｍＬ。
２．２吸附速率对吸附率的影响
配制浓度为０．３１１ ｍｇ／ｍＬ的粗黄酮溶液５００ ｍＬ，均分成５份，分别以０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ ｍＬ／ｍｉｎ的速率过柱，并用３倍床体积的水洗柱，收集吸附及洗柱流出液，测量其中的总黄酮含量，据此计算出不同吸附速率下的吸附率如图３。由图３可以看出，随着吸附速率的增大，吸附率逐渐降低，但当吸附速率太小时花费的时间就会很多，并且当吸附速率由０．５ ｍＬ／ｍｉｎ增大到１．０ ｍＬ／ｍｉｎ时，吸附率只是略微降低，却节省了１／２的时间；而当吸附速率大于１．０ ｍＬ／ｍｉｎ时，虽然花费的时间减少了，但吸附率却急剧下降。综合考虑以上因素，选择吸附速率为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ比较合适。
２．３样液ｐＨ值对吸附率的影响
配制浓度为０．３１１ ｍｇ／ｍＬ的粗黄酮溶液５００ ｍＬ，均分成５份，用５％的ＨＣｌ将它们的ｐＨ值分别调至１、２、３、４、５，然后均以１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的速率过柱，再用３倍床体积的水洗柱，收集吸附及洗柱流出液，按照步骤１．２．２的方法测量其中的总黄酮含量，据此计算出不同ｐＨ值下的吸附率如图４。据图４可看出，当ｐＨ值小于２时，随着样液ｐＨ值的增大，吸附率相应地增大；当ｐＨ值大于２后，随着ｐＨ值的增大，吸附率明显地降低；当ｐＨ值为２时吸附率可达最大值。因此过柱前要调好溶液的酸碱度，使其ｐＨ值为２，以便增大大孔树脂对总黄酮的吸附能力。
２．４上样量对吸附率的影响
配制浓度为０．３１１ ｍｇ／ｍＬ的粗黄酮溶液１ ５００ ｍＬ，分别从中取出总黄酮量为４０、６０、８０、１００、１２０ ｍｇ的溶液，均以１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的速率过柱，并用３倍床体积的水洗柱，收集吸附及洗柱流出液，按步骤１．２．２的方法测量其中的总黄酮含量，据此计算出不同上样量下的吸附率如图５。由图５可知，当上样量小于６０ ｍｇ时，随着上样量的增加，吸附率略有减小；上样量在６０～８０ ｍｇ之间时，随着上样量的增加，吸附率略有增大；上样量大于８０ ｍｇ后，随着上样量的增加，吸附率明显减小。总体上看，上样量为４０～８０ ｍｇ时，吸附率变化不大；虽然上样量小有利于吸附，但上样量太小，大孔树脂的利用率太低。因此，当上样量为８０ ｍｇ时，既能保持较大的吸附率，又使得大孔树脂的利用率较高。根据所用大孔树脂的量为１６ ｇ来计算，可算出平均每克大孔树脂的上样量为５ ｍｇ时，吸附率和大孔树脂的利用率都比较高。所以，试验前要根据所用大孔树脂的量来确定上样量，使平均每克大孔树脂的上样量为５ ｍｇ。
２．５洗脱剂体积分数对解吸率的影响
配制浓度为０．３１１ ｍｇ／ｍＬ的粗黄酮溶液５００ ｍＬ，均分成５份，均以１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的速率过柱，分别用３倍床体积的水洗柱，并收集吸附及洗柱流出液，再用４倍床体积的体积分数分别为３０％、５０％、７０％、８０％、９０％的乙醇溶液以１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的速率洗脱，收集洗脱液。按步骤１．２．２的方法测量其中的总黄酮含量，据此计算出不同体积分数的洗脱剂下的解吸率如图６。
由图６可以看出，当洗脱剂体积分数小于７０％时，随着洗脱剂体积分数的增大，解吸率也增大；当洗脱剂体积分数为７０％时，解吸率达最大值；当洗脱剂体积分数大于７０％后，随着洗脱剂体积分数的增大，解吸率逐渐减小。所以，洗脱时用体积分数为７０％的乙醇，洗脱效果最好。
２．６洗脱速率对解吸率的影响
配制浓度为０．３１１ ｍｇ／ｍＬ的粗黄酮溶液５００ ｍＬ，均分成５份，均以１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的速率过柱，分别用３倍床体积的水洗柱，并收集吸附及洗柱流出液，再用４倍床体积的体积分数为７０％的乙醇溶液洗脱，洗脱速率分别为０．５、１．０、２．０、３．０、４．０ ｍＬ／ｍｉｎ，收集洗脱液，按步骤１．２．２的方法测量其中的总黄酮含量，据此计算出不同洗脱速率下的解吸率如图７。由图７可看出，随着洗脱速率的增大，解吸率减小，因此，按说洗脱速率小有利于解吸率的增加；但洗脱速率太小就需要花费很多时间。同时由图７可以看出，洗脱速率在０．５～１．０ ｍＬ／ｍｉｎ之间解吸率大，且随着洗脱速率的增加，解吸率降低很小，却节省了１／２的时间；而当洗脱速率大于１．０ ｍＬ／ｍｉｎ时，虽然所用时间减少，但解吸率急速减小。考虑以上因素，将洗脱速率定为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ比较合适。
２．７洗脱剂用量对解吸率的影响
配制浓度为０．３１１ ｍｇ／ｍＬ的粗黄酮溶液５００ ｍＬ，均分成５份，均以１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的速率过柱，分别用３倍床体积的水洗柱，并收集吸附及洗柱流出液，分别用２、３、４、５、６倍床体积的体积分数为７０％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，按步骤１．２．２的方法测量其中的总黄酮含量，据此计算出不同用量洗脱剂下的解吸率如图８。由图８可看出，洗脱剂用量从２倍床体积增加到４倍床体积时，解吸率显著增大；洗脱剂用量大于４倍床体积时，随着洗脱剂用量的增加，解吸率几乎不再变化。因此，洗脱剂用量为４倍床体积时，洗脱效果最好。
２．８最佳条件下的纯化效果
配制浓度为０．３１１ ｍｇ／ｍＬ的粗黄酮溶液２５０ ｍＬ，ｐＨ值调为２，以１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的速率过柱，用３倍床体积的水洗柱，再用４倍床体积的体积分数为７０％的乙醇溶液以１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的速率洗脱，将洗脱液用旋转蒸发仪浓缩到一定体积，再减压干燥成粉末。然后按步骤１．２．２的方法测得其总黄酮的含量为６０．１％，约是过柱前含量的３．１倍。
３结论
用ＡＢ－８型大孔吸附树脂为吸附剂对粗黄酮进行纯化，受到各种因素的影响，包括样液浓度、吸附速率、样液ｐＨ值、上样量对吸附率的影响及洗脱剂体积分数、洗脱速率、洗脱剂用量对解吸率的影响，这些因素对纯化效果有很大的影响。研究发现，当样液浓度为０．３１１ ｍｇ／ｍＬ，ｐＨ值为２，吸附速率为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，上样量为每克大孔树脂５ｍｇ粗黄酮溶液，吸附率可达最大值；再用４倍床体积的体积分数为７０％的乙醇溶液以１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的速率洗脱可使解吸率达到最大值。当吸附率和解吸率都达到最大值时，即为试验所需的最佳条件。在最佳条件下，通过ＡＢ－８型大孔吸附树脂的纯化，使得粗黄酮中的总黄酮含量由原来的１９．３％增大到６０．１％，是原含量的３．１倍。
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