microRNA与左室肥厚
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[摘要]微小RNA（microrna， miRNA）在生物发育及疾病发生发展过程中发挥重要的作用，其在生物学中起着类似于“总开关”的作用。原发性高血压患者中约有1/3的患者会出现左室肥厚，是心血管病发生的独立危险因素。而miRNA在左室肥厚的发生发展中起到了重要作用。该文回顾了miRNA在压力信号通路的调节作用，并明确了其对左室肥厚形成的影响，进一步强调了miRNA作为生物标志物和治疗靶点的机遇和挑战。
[关键词]microRNA；左室肥厚；评述；机制；信号通路
miRNA无论是在生物发育还是疾病发生发展过程中都有重要的作用。左室肥厚是心血管病的独立因素。明确miRNA在左室肥厚形成及发展中的作用，可为临床诊断和治疗提供新的思路。
1 microRNA概述
生命科学进入“后基因组时代”后，主要的目标是系统地阐明基因组及其包含基因的功能和调控机制。基因调控是一个多渠道、多层次、多方式的时空动态过程。现已知道，在调控中，miRNA起到了调控分子的重要作用。
miRNA是一类高度保守的非编码小分子RNA，由约22个核苷酸构成。通过对mRNA进行切割或抑制翻译，促进mRNA降解或抑制其转录发挥蛋白水平的调节功能，从而参与许多重要的生物进程。
miRNA的合成，是从RNA聚合酶Ⅱ转录生成原始miRNAs （pri-miRNAs）开始的。Pri-miRNAs通过由核内的RNA内切酶Ⅱ（RNAse-Ⅱ）Drosha，切下一个长约65～75个核苷酸的发卡结构，形成miRNAs前体（pre-miRNAs）。Pre-miRNAs由Ran-GTP/Exportin 5从细胞核转运到细胞质。在细胞质中，pre-miRNAs由RNA内切酶Dicer等进行第二阶段裂解，生成1种含2个3′袢状结构的小片段双链 miRNA 复合体。多数学者认为，这些双链 miRNA 产物很快被一种尚未明确的解旋酶，很可能为Dicer的酶松解成为成熟的miRNA单链，并结合到RNA介导的沉默子复合体 （RNA-induced silencing complex， RISC）中，从而发挥作用。另一条链则被降解。
目前已发现了一些miRNAs的生物学特性，其在发育和组织分化中起重要作用。有学者发现，大鼠心脏的miRNA在心脏的发育中极其重要。肌肉特异性miRNA，miR-1-2的靶向敲除发挥了心脏的很多功能，包括心脏形态形成，电传导和细胞循环控制的调节。敲除后，miR-1互补序列基因上调，使miR-1位于身体易感区域产生大量的匹配点和潜在的有强烈结合倾向的结合位点。结果表明，miRNA含量的微妙变化，可以产生深远的影响，揭示了miRNA可以对生理功能损害的哺乳动物模型进行靶点修复[1]。
miRNA-21可降低VSM的增生，而增加其凋亡。其在退行性变化血管细胞中的表达水平远高于新鲜血管细胞，说明其有调控细胞生长凋亡的作用。在血管平滑肌（vascular smooth muscle，VSM）中，Cre-Lox介导的Dicer基因删除可导致第16～17天胚胎平滑肌细胞增殖和分化减少，从而导致胚胎死亡。突变体胚胎表现出血管壁较薄，收缩功能受损和易出血[2]。据推测，人类基因组中约30%基因受miRNA调节。同一种 miRNA可能同时参与100多个基因的表达调节，而同一基因的表达可能同时受多种 miRNA调节。目前为止，约有300多个哺乳动物miRNA已被证实，但只有极少miRNA的作用靶点被确定，阻碍了以miRNA为基础调解网络的认识[3]。
2 miRNA与左室肥厚
2.1 miRNA与左室肥厚发病机制 原发性高血压患者中约有1/3的患者会出现左室肥厚（left ventricular hypertrophy，LVH）。长期持续的血流动力学超负荷引起心脏的病理性肥厚，但许多高血压患者的血压已经被控制，左室质量却仍然在逐渐增加。血流动力学超负荷不是引起LVH的唯一因素，局部的神经内分泌激活或许在LVH的发展过程中起着更为重要的作用。研究表明，其受到3种刺激信号的影响，包括机械性因素、神经体液因素和细胞因子，通过PKC，MAPKs及其介导的信号通路等最终导致转录基因的活化导致了LVH[4]。无论是心脏机械因素，神经体液因素，还是细胞因子所引起LVH，都是通过各细胞内外信号传导途径导致一种或几种原癌基因（如c-fos，c-myc，c-jun，egr-1）和胚胎基因（如ANF，βMHC，SKA）的激活和表达。而miRNA可以调节mRNA的表达，所以左室肥厚的发生和发展是否会通过影响miRNA而发生是一个有趣的问题。
分析表明，心肌细胞肥大与压力超负荷引起的心脏肥厚时，miRNA表达谱有所改变。进一步的研究发现，内源性miR-21或miR-18b能够抑制心肌细胞的肥大生长。如果阻滞了内源性miR-21或miR-18b，则会使得心肌细胞肥大[5]。有研究用微列阵分析法发现心室肥厚大鼠，众多miRNA中有19个表达异常。其中，miR-21较假手术组高出4倍以上。而通过反义介导抑制miR-21的表达可以显著抑制心肌细胞肥大[6]。miR-21在心肌细胞过度表达，会出现一类特殊的“连接物”，可以在细胞间的形成细长的突起和分支。Spry2是分支形态和突起伸出的抑制剂。随后证实miR-21直接作用于它，可以下调其表达。而β肾上腺素受体的刺激可以诱导miR-21的上调和Spry2的下调，所以它与细胞的连接分支相关。抑制Spry2则会出现心肌细胞的分支形态，反之亦然，用特定的miRNA擦除器（miRNA eraser）敲除miR-21或过表达Spry2会抑制β肾上腺素受体诱导的细胞突起。这些结构通过缝隙连接功能包裹肌小节并连接相邻的心肌细胞。所以，miR-21对心肌细胞作用是通过下调Spry2水平，增强多种细胞突出的形成而实现的[7]。
miR-15/16家族的成员也是重要的压力信号调节物，它们可以在心肌遭到伤害后调节心肌细胞增生和存活。它的水平进一步升高可能导致心肌肥厚，心肌梗死，引起不可逆转的心肌细胞坏死和心脏功能失常，而BCL2是其重要的靶基因[8]。在SHR大鼠mir-208a抑制剂全身给药后，延迟了SHR大鼠心脏功能障碍的发病，确定该miRNA在病理性心肌重塑的关键作用，提示miR-208a抑制剂是心脏病的潜在治疗药物。miR-208a也被认为在心血管疾病中有压力信号的调节作用。心脏病的一个标志是成人的α肌球蛋白重链（αmyosin heavy chain，αMHC）亚型转变为胎儿b-MHC基因的表达，同时伴有心脏功能的缩减。miR-208a被α内含子的MHC基因编码，在心脏与其宿主基因一起进行特异性表达[9]。miR-208a基因敲除小鼠在慢性压力条件下免于病理性心脏重塑，表明导致许多心脏疾病的压力反应需要miR-208a的参与。miR-208a的作用被一组支配心脏的应激反应基因表达的转录阻遏蛋白所调节。Thrap1/MED13是调解复合物的一个组成部分，也是miR-208a最强靶点之一[10]。miR-208a的缺失，Thrap1（和其他靶点）的上调，被认为会阻碍下游胁迫应答基因的激活，包括b-MHC[11]。
心脏压力也通过激活NFAT转录因子诱导miR-23a/27a/24-2簇的表达，作为钙敏感磷酸酶的感受器[12]。miR-23a，反过来，发现可抑制肌肉特异的泛素连接酶MuRF1，建立一个积极的反馈，保持应力依赖性心脏肥大。用miRNA抑制剂将miR-23a敲除，通过减弱这种积极反馈来抵抗心脏压力和减少心肌肥厚。钙依赖磷酸酶/NFAT信号通路也诱导miR-199a的表达[13]，对抑制NFAT的蛋白激酶Dyrk1a有负面调节作用，从而进一步在心脏增强病理信号。令人欣喜的是，miR-199a抑制剂已经被报道通过Dyrk1a活性的提高不仅能够预防压力下心室肥厚和纤维化，更能逆转病理进程。
肌肉特异性miRNA包括miR-1和miR-133在调节心肌细胞增殖和分化中有重要影响。miR-1早在胚胎形成的第8天就开始在大鼠心脏内表达，而且随着分化的进程而增加。当αMHC促进剂的过表达时，miR-1会抑制肌细胞的增殖和心脏的生长。miR-1不参与肌肉的生长，但它会参与有丝分裂后期的肌肉生长和功能。在心肌肥厚的病理进程中，miR-1和 miR-133的水平降低。反之，miR-1和miR-133的过度表达可以抑制心肌肥厚反应[14]。 而Cdk9是 miR-1的其中一个靶基因[15]，见表1。
2.2 miRNA 作为左室肥厚的生物标志物 miRNAs的生物学方面有一个特别有趣的但很难理解的问题，他们出现在众多的体液里，包括血清，血浆，唾液，羊水[16]，使其能够方便快捷地提取并用于检验。循环中的miRNA与很多心血管疾病相关，包括心肌梗死，心室肥厚以及心衰[17]。
阵列分析显示平均1/3的miRNA在血清中是可发现的。对一系列被选定的miRNA中，高血压诱发心室肥厚，心力衰竭能够引起循环中miR-16，miR-20b，miR-93，miR-106b，miR-223和miR-423-5p的水平显著增高，而应用miR-208a抑制剂和ACEI都将使以上miRNA增高减缓。另外，用miR-208a抑制剂进行治疗导致一种miRNA的戏剧化增加，就是miR-19b。一段时间的研究表明，这些miRNA的变化与疾病的进展一致[18]。
解剖样品像心脏一样无法得到时，在外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）miRNA的标记很有潜力用于预测病理变化。高保真度全基因组表达分析技术让这成为可能。分析来自48个non-failing controls和44个有扩展性心肌病和稳定性慢性心衰患者（射血分数
这些研究说明细胞外miRNA可以作为疾病的潜在生物标志物的。但必须指出大多数研究，包括有相关小样本患者的研究都强调需要有更大样本量的人类研究才能确定其临床应用价值。
2.3 miRNA 作为左室肥厚的治疗靶点 正如整个回顾详细描述的是，增益和丧失功能的miRNA的研究出现了一个主要的范式，miRNA失调是在正常组织中耐受性良好，但却可以深深地影响细胞和组织应对病理应激反应。由此得出结论miRNA抑制和靶向可能提供一种良好潜力的调节疾病的方法同时还可以避免不想要的对正常组织的毒副作用。这种潜在的治疗窗宽（a wide therapeutic window）使得研究者在miRNA靶向治疗的发展付出了巨大努力。
miRNA很容易被反义寡核苷酸和各种各样的修改抑制。这种修改已经发展到提高抗miRNA的特异性，效价，以及生物有效性。反义寡核苷酸与LNA修饰，长度范围从7～20单位的核苷酸，可通过静脉注射，腹腔或皮下注射以全身给药，毒性很小或根本没有[20]。在全身给药，抑制性的LNA寡核苷酸绝大部分通过肝脏和肾脏清除[21]。
但另一方面的工作还存在挑战，根据有趣的观察表明，在某些情况下，一个miRNA的短期化学抑制已被发现是有益的治疗反应而miRNA基因缺失对疾病进程却并没有影响。例如，靶向为miR-21的抑制剂能够预防病理性心脏重塑，而miR-21的种系缺失对心血管病理学发展并没有效果[22-23]。而这些截然不同的结果可能表明miR-21抑制剂的有益效果是由于在特定的细胞类型或脱靶效应中抗miRNA的选择性吸收或激活，另一个可能是miRNA的适应性反应的结果，miRNA的目标网络内的慢改变代偿了基因缺失。这种理论的影响提出了一个有趣的问题，用miRNA抑制剂治疗疾病的即时与长期治疗效果。到目前为止，大多数涉及miRNA抑制的动物研究是在相对较短时间内的。无论是miRNA抑制剂疗效将随着时间减弱，还是为了减少miRNA活性的目标网络代偿而减效，仍有待确定。
3 展望
20世纪90年代在线虫的发育时间的突变体色分析中被首次发现[24-25]。随后小RNA的得到了大量的确认。在接下来的10年间，miRNA生物学的研究吸引了非凡的目光，得以迅速的发展。之后发现哺乳动物基因组编码300个保守的miRNA基因，和高通量测序的研究已经确定了1 000个或更多的位点产生的类似于miRNA的小分子RNA结构。几乎参与各种生物学功能（从细胞分化、增殖和凋亡到病理生理状态）。在哺乳动物中的小分子RNA的不同类别中，miRNA似乎在疾病产生、发展中起到了无可替代的重要作用，因此将全部注意力集中在他们的功能。
左室肥厚首包括机械性因素、神经体液因素和细胞因子3种刺激信号的影响。通过个细胞内外信号传导途径导致原癌基因和胚胎基因的激活和表达，并受到miRNA调节的影响。心室肥厚的大鼠miR-21的表达水平高出假手术组4倍以上，其引入可以通过下调Spry2水平抑制心肌细胞的肥大。miR-15/16家族也可导致心肌肥厚，甚至心肌梗死。miR-208a通过对Thrap1/MED13的调节进而造成病理性心脏重塑。心脏压力也通过激活NFAT转录因子诱导miR-23a/27a/24-2簇的表达，导致应力依赖性心脏肥大。肌肉特异性miRNA包括miR-1和miR-133在调节肌细胞增殖和分化中有重要影响。心肌肥厚时，miRNA-1表达水平也明显升高，并抑制Cx43蛋白。miRNA在左室肥厚的形成中起到重要的作用。
心脏无法得到病理样本，而在PBMC中miRNA的标记就很有潜力用于预测病理变化。PNMC的miRNA-548家族标记与心室肥厚和早期心衰息息相关，能够用于检测。而miR-208a，miR-19b与左室肥厚的病理进展一致，可以作为有潜力的生物标志物。这些研究说明细胞外miRNA可以作为疾病的潜在生物标志物的。但必须指出大多数研究，包括有相关小样本患者的研究都强调需要有更大样本量的人类研究才能确定其临床应用价值。
miRNA抑制剂的作用被广泛应用于miRNA功能的研究。这也为研究miRNA抑制剂治疗疾病的作用铺路。增益和丧失功能的miRNA的研究出现了一个主要的范式，miRNA失调可以对细胞和组织的病理反应产生深远的影响。但研究中也发现一个现象，miRNA的短期化学抑制已被确认为有益的治疗反应而miRNA基因缺失对疾病进程却并没有影响。miRNA抑制剂疗效的减弱到底是因为时间，还是为了减少miRNA活性的目标网络代偿而减效，仍有待确定。这也对miRNA靶向治疗的发展有重要意义。
miRNA在生物发育及疾病发生发展过程中发挥重要的作用，其在生物学中起着类似于“总开关”的作用。而现在越来越多的证据表明中医药治疗左室肥厚具有全面改善症状、标本同治以及减少并发症的优势与作用[26-30]。因此，笔者认为中医药可能对于疾病的miRNA调控网络具有一定的干预影响，但是中医药对于高血压病miRNA的影响尚不清楚，这方面的证据还有待进一步加强。
肾虚是高血压病的关键证型。年老导致的生理性肾虚，大病、久病，降压西药治疗作用和不良反应导致肾虚都是高血压病肾虚的关键。而长期的高血压与心室肥厚密切相关。肾虚很有可能是心室肥厚的重要证型。作者实验研究发现补肾降压方对于miR-1的影响，能够上调miR-1进而抑制ERK通路，但是有待更多的临床证据支持中医药对心室肥厚miR的影响[31]。
由于miRNA在生物体内发挥的重要作用，其可能成为疾病诊断的新的生物学标记，并进一步成为药物靶点，从基因角度对疾病进行治疗。模拟miRNA进行新药研发，可能会给人类疾病的治疗提供一种新的手段。研究中医药对高血压病miRNA调控的影响可能能在转录后水平上揭示中医药治疗高血压病的作用机制，进一步明确中医药的深层次的作用靶点。
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MicroRNA and left ventricular hypertrophy
DUAN Lian， XIONG Xing-jiang， LIU Yong-mei， WANG Jie*
（Guang′ anmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）
[Abstract]MicroRNAs （miRNA） plays an important role in biological development and disease occurrence and development， and acts as a ″main switch″ in biology. Among patients of essential hypertension， around 1/3 would suffer left ventricular hypertrophy （LVH）. Hence， essential hypertension becomes an independent risk factor for cardiovascular diseases. And miRNAs plays an important role in the occurrence and development of LVH. This paper reviewed the role of miRNA in regulating the stress signaling pathway， defined its impact on the occurrence of LVH， and further emphasized the opportunities and challenges of miRNA as a biomarker and therapeutic target.
[Key words]microRNA； left ventricular hypertrophy； review； mechanism； signaling pathway
doi：10.4268/cjcmm20141701