长白山蜂胶的生物活性分析

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摘要：对长白山蜂胶的抗氧化、抗疲劳和抑菌能力进行了分析。结果表明，该蜂胶清除羟基、DPPH和超氧阴离子3种自由基的能力随其浓度的增大而增强；蜂胶可显著延长小鼠游泳、爬杆力竭时间，小鼠的肝糖原和肌糖原储备显著增加，血乳酸变化幅度很小；蜂胶对细菌的抑制作用明显强于真菌，对9种细菌的最小抑制浓度MIC为25～1 600 μg/mL。长白山蜂胶具有较强的生物活性。

关键词：蜂胶；生物活性；抗氧化；抗疲劳；抑菌

中图分类号：S896.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）02-0430-05

蜂胶（Propolis）是由蜜蜂采集植物树脂、叶芽及伤愈组织分泌物并混入蜂蜡、花粉等经咀嚼加工而成的一种黏稠物质，蜂胶中含有蜜蜂上颚腺、蜡腺等的分泌物，属于动植物双源性物质[1]。北温带的蜂胶主要来源于杨树、桦树和针叶树等植物的树脂[2]。蜂胶是蜜蜂用于维持整个群体健康的有效物质，是蜜蜂献给人类的一种最独特、最神奇的天然物质， 被称为“紫色黄金”。蜂胶是不透明的固体，表面光滑或粗糙，折断面呈沙粒状。味微苦，略带辛辣味，嚼之粘牙，低于15 ℃时变硬、变脆，易粉碎；高于36 ℃时质软，有黏性和可塑性[3]。蜂胶的化学成分复杂，目前已发现200多种组分，主要包括黄酮类、酚醛类、萜类、酯类和有机酸类等，另外还有多种维生素、氨基酸以及镁、镉、铁、锌、锶、钴等微量元素[4]，其中黄酮类化合物达70多种，是蜂胶质量的主要评价依据。蜂胶味苦、辛，性寒，归脾、胃经。内服补虚弱，化浊脂，止消渴；外用解毒消肿，收敛生肌。近年来，大量研究发现蜂胶具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抑制肿瘤以及双向调节血糖等重要的生理功效[5]。

近年来，随着生活水平提高，人们保健意识日益增强，具有营养和保健功能的蜂产品越来越受到青睐[6]。本试验以长白山蜂胶为原料，通过抗氧化、抗疲劳、抑菌等能力的研究，对其生物活性进行了分析，以期为长白山蜂胶的开发与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

超临界流体萃取仪（南通华安HA121-50-01）、紫外-可见光度计（岛津UV-1700）、高速中药粉碎机（温州LG-08A）、空气振荡器（哈尔滨HZQ-C）、真空泵（昆山SHB-III）、旋转蒸发仪（步琪R-210）、离心机（江苏金坛800型）、恒温干燥箱（上海101-O-BS）、匀浆机（漯河金田JT-B）、超声波清洗器（昆山KQ3200DB）、恒温培养箱（上海比朗HWS-150）、冰箱（海尔BCD-215KA）、电子天平（梅特勒 XL-204）。

1.2 原料与试剂

原蜂胶样品，购于吉林省养蜂科学研究所；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH），购于Sigma公司；2，6-二叔丁基对甲酚（BTH）和没食子酸丙酯（PG）均为食品级，购于河南省所以仪工有限公司肝糖原标准液，肌糖原标准液，尿素氮测定试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。

无水乙醇、三氯甲烷、甲醇、铁氰化钾、磷酸、三氯乙酸、双氧水、硫酸亚铁、水杨酸、邻苯三酚、丙酮、乳酸、冰乙酸、碘化钾、硫代硫酸钠、乙醚、酚酞、氢氧化钾、氟化钠等（以上试剂均为分析纯）。

牛肉膏蛋白胨液体培养基、PDA培养基、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、普通变形杆菌、产气杆菌、啤酒酵母、假丝酵母、黑曲霉（以上菌种、培养基均由吉林农业科技学院微生物研究室提供）。

试验动物：昆明种雄性小鼠6～8周龄，体重18～22 g，由吉林正业生物制品有限公司动物室提供。

1.3 方法

1.3.1 蜂胶萃取液的制备 将原蜂胶样品冷冻、粉碎后，取50.0 g，加入10.0 g滑石粉混合均匀后装入萃取斧中，以体积分数为75%的乙醇作为夹带剂，采用超临界CO2流体萃取法萃取蜂胶。其中萃取温度为40 ℃，萃取压力为30 MPa；分离1压力为8 MPa，温度为45 ℃；分离2压力为6 MPa，温度为40 ℃。循环萃取，间隔30 min，从分离1中取萃取物至无。

1.3.2 清除自由基能力的测定 取2.5 mL 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μg/mL蜂胶萃取物乙醇液、BHT 和PG 乙醇溶液，加入0.2 mol/L pH6.6磷酸缓冲溶液2.5 mL及质量分数为1%的铁氰化钾2.5 mL，50 ℃水浴20 min后急速冷却，加入质量分数为10%的三氯乙酸溶液2.5 mL 3 000 r/min离心10 min，取上清液5 mL，加蒸馏水4 mL及质量分数为0.1%的FeCl3 1 mL 混匀放置10 min，于700 nm处测定吸光值。

1.3.3 羟基自由基清除率的测定 分别于6个10 mL容量瓶中加入9 mmol/L FeSO4 2 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇2 mL、0～150.0 μg/mL上述蜂胶提取液2 mL后，加8.8 mmol/L H2O2 2 mL，37 ℃水浴0.5 h，以去离子水为对照溶液，测定各样品在510 nm处的吸光度。

1.3.4 超氧阴离子清除率的测定 分别于6个10 mL锥形瓶中加入pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液4.5 mL，再加入0～100.0 μg/mL蜂胶乙醇萃取液4.2 mL，混匀，25 ℃水浴20 min后，加入25 ℃预热的3 mmol/L邻苯三酚0.3 mL（以10 mmol/L HCl 配制，设置相同浓度HCl溶液为空白对照） ，迅速摇匀后倒入比色杯，于325 nm处间隔30 s测吸光度，计算线性范围内每分钟吸光度的增加值。

1.3.5 DPPH自由基清除率的测定 分别于6个三角形瓶中加入2.0 mL的0～100.0 μg/mL的蜂胶萃取液，再加入0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液2 mL，充分混匀后，室温避光静置30 min后，于517 nm处测定吸光度。

1.3.6 动物试验 将小鼠随机分为4组，包括：对照组、低剂量、中剂量组和高剂量组，每组12只。饲养试验剂量分别对应为0.0、0.3、0.5和1.5 g/kg的蜂胶萃取物乙醇液，对照组给同体积去离子水，采取灌胃法（0.2 mL/10 g体重，间隔24 h）连续给予受试小鼠28 d后，测定如下指标：

1）游泳试验。末次给予小鼠不同剂量的蜂胶液30 min后，小鼠尾根部负荷5%体重的铅皮，放入水温25 ℃、水深35 cm的游泳箱中，记录自游泳开始至头部全部沉入水中不能浮出水面的时间作为小鼠游泳时间。

2）爬杆试验。末次给予小鼠不同剂量的蜂胶液30 min后，将小鼠放在爬杆架的有机玻璃棒上，使其肌肉处于紧张状态，记录小鼠由于肌肉疲劳跌落下来的时间，第3次跌落时终止试验，累计3次时间为爬杆时间。

3）血尿素的测定。末次给予小鼠不同剂量的蜂胶液30 min后，将小鼠置于25 ℃游泳箱中游泳90 min，休息60 min后眼内眦静脉丛取血，血清用试剂盒（二乙酰一肟法）测定血尿素含量。

4）血乳酸的测定。末次给予小鼠不同剂量的蜂胶液30 min后，将小鼠放于30 ℃的水中负重5%体重游泳10 min后，分别于游泳前以及游泳后的0、20、60 min，在小鼠眼内眦静脉丛取血。于5 mL离心管中加入1%（m/V） NaF溶液0.48 mL，吸取全血20 μL加入离心管底部，用离心管上清液冲洗微量吸管数次，再加入蛋白沉淀剂1.5 mL，振荡混匀，3 000 r/min 离心10 min，取上清液用浓硫酸-对羟基联苯法测定血乳酸含量。

5）肝糖原的测定。末次给予小鼠不同剂量的蜂胶液30 min后，将小鼠于30 ℃的水中游泳90 min，立即处死小鼠，精确称取200 mg鼠肝，加入4 mL三氯乙酸（TCA），匀浆1 min，3 000 r/min离心15 min，取上清液至另一试管内，在沉淀中加入TCA 4 mL，匀浆1 min，离心15 min后合并上清液，充分混匀。取 1 mL 上清液，每管加入体积分数95%的乙醇4 mL，充分混匀，室温过夜，3 000 r/min离心15 min，弃上清，加入1 mL 去离子水充分溶解沉淀后用蒽酮法测定肝糖原含量。

6）肌糖原的测定。末次给予小鼠不同剂量的蜂胶提取液30 min后，将小鼠放于30 ℃的水中游泳90 min，立即处死小鼠，取出后腿部肌肉，以0.9% （m/V） NaCl 溶液冲洗，用滤纸吸干，准确称取1.000 g肌肉于盛有3 mL 30% （m/V） KOH 的试管中，沸水浴20 min，冷却后将其转移至50 mL 容量瓶中，以去离子水多次洗涤，合并收集，再次沸水浴10 min，冷却后定容，并于620 nm处测定肌糖原含量。

1.3.7 抑菌试验 称取适量1.3.1中的蜂胶萃取物，以体积分数95%的乙醇稀释成0.8%、0.4%、0.2%、0.1%蜂胶液。从新鲜菌苔斜面上挑取一环供试菌，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，细菌于37 ℃摇床培养18 h，真菌于28 ℃摇床培养24 h，培养后用无菌水制备成约109 CFU/mL的菌悬液，备用。

1）抑菌圈的测定。吸取0.2 mL上述菌悬液，分别涂布于牛肉膏蛋白胨平板或马铃薯琼脂糖平板上，每菌设3个平行。取灭菌圆形滤纸片（D=12.5 mm），分别浸入不同浓度蜂胶提取液中浸泡l h，以体积分数95%的乙醇为空白对照。将滤纸片置于平板中央后，倒置平板，4 ℃静置2 h，再置于培养箱培养，其中细菌37 ℃培养24 h，真菌28 ℃培养48 h），测定抑菌圈直径的平均值。

2）最小抑菌浓度的测定。配制菌液终浓度为106 CFU/mL以及梯度浓度的蜂胶萃取物液体培养基（牛肉膏蛋白胨或者马铃薯琼脂糖），同时以无菌生理盐水为空白对照。将其置于培养箱培养（细菌37 ℃培养24 h，真菌28 ℃培养48 h）中，观察微生物生长情况，确定最小抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 还原力的测定

BHT、PG和蜂胶萃取液的吸光度随浓度增大逐渐增加，其增加的趋势为：蜂胶>BHT>PG，蜂胶在12 μg/mL时的还原力高于80 μg/mL的PG和60 μg/mL的BHT。三者的还原力均与其浓度呈线性关系，其中蜂胶的回归方程为y=-0.016 2+0.054 9x，r2=0.939 9，F=62.559；BHT的回归方程为y=-108.330 7+1.725 9x，r2=0.960 6，F=48.808。PG的回归方程为y=0.044 3+0.009 1x，r2=0.963 8，F=79.963，三者还原力强弱为：蜂胶>BHT>PG（图1、图2）。

2.2 对羟基自由基的清除作用

由图3可知，蜂胶在10～150 μg/mL范围内对清除羟基自由基有较好的量效关系，在10～50 μg/mL范围内随浓度的增加对羟基自由基的清除率明显增强，当浓度大于100 μg/mL时，随浓度的增加，其清除率增加不明显。以浓度为横坐标，清除率为纵坐标，其回归方程为y=-0.007 9x2+1.940 8x-15.835 0，r2=0.989 4。

2.3 对超氧阴离子的清除作用

由图4可知，在20～100 μg/mL时，蜂胶对超氧阴离子具有较好的量效关系，在40～100 μg/mL的范围内随浓度的增加对超氧阴离子的清除率明显增强。但是在浓度小于40 μg/mL时，蜂胶对超氧阴离子的清除作用不明显。以浓度为横坐标、清除率为纵坐标，得其回归方程为y=0.009 2x2-0.270 7x+5.360 0，r2=0.997 3。

2.4 对DPPH自由基的清除作用

由图5可知，在20～100 μg/mL时，其线性关系较差，在20～40 μg/mL和60～80 μg/mL范围内呈量效关系。在20～100 μg/mL间，随蜂胶浓度的增加，对DPPH自由基的清除率也增强。以浓度为横坐标、清除率为纵坐标，得回归方程为y=0.008 6x2+1.614 1x+16.600 0，r2=0.950 2，结果表明蜂胶浓度与DPPH自由基的清除率呈正相关。

2.5 蜂胶对小鼠游泳、爬杆时间的影响

蜂胶对小鼠游泳和爬杆时间的影响结果见表1。由表1可知，服用蜂胶可以显著延长小鼠的游泳、爬杆力竭时间。试验组与对照组相比，小鼠游泳时间、爬杆时间都有不同程度的延长。高剂量组游泳时间延长了55%（P

2.6 蜂胶对小鼠血尿素、肝糖原和肌糖原含量的影响

结果见表2，由表2可知，试验组与对照组相比，高剂量组血尿素含量降低了17%（P

2.7 蜂胶对血乳酸含量的影响

试验组小鼠和对照组小鼠的血乳酸含量随游泳时间的变化而变化，高剂量组小鼠游泳30 min比游泳10 min下降67%，对照组游泳30 min比游泳10 min下降35%，但高剂量组仍比对照组下降了32%（P

2.8 抑菌圈试验

采用滤纸片法测定蜂胶超临界萃取物对9种受试菌种的抑制作用，结果见表4。由表4可知，不同浓度（m/V）蜂胶提取液对大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、产气杆菌具有明显的生长抑制作用，对黑曲霉、沙门氏菌[7]、普通变形杆菌、啤酒酵母、假丝酵母也有一定的生长抑制作用，并且浓度越大，抑菌效果越好。

2.9 最小抑菌浓度（MIC）的试验

采用试管稀释法测定蜂胶提取液的最低抑菌浓度，结果见表5。由表5可知，蜂胶提取液对细菌的抑制作用明显强于真菌，9种菌的MIC为25～1 600 μg/mL。蜂胶提取物对革兰氏阳性菌抑菌作用较好，对革兰氏阴性菌抑制作用不显著。

3 小结

蜂胶在12 μg/mL时的还原力比80 μg/mL的PG和60 μg/mL的BHT高，三者的还原力强弱依次为蜂胶>BHT>PG；蜂胶在10～150 μg/mL 范围内对清除羟基有较好的量效关系；在20～100 μg/mL范围，对超氧阴离子自由基具有比较好的量效关系，蜂胶的浓度越大，清除自由基的能力越强。动物试验表明，蜂胶可以显著延长小鼠的游泳、爬杆力竭时间，其抗疲劳作用显著。蜂胶提取液对细菌的抑制作用明显强于真菌，蜂胶提取物对革兰氏阳性菌抑菌作用较好，对革兰氏阴性菌抑制作用不显著。

参考文献：

[1] 李雅晶，黄美珍，胡福良.蜂胶的挥发性成分及其生物学活性研究进展[J].蜜蜂杂志，2011，31（1）：1-5.

[2] 黄文诚.蜂胶的生物活性和药理作用的研究进展（一）[J].蜜蜂杂志，2006，7（8）：10-12.

[3] 刁青云，闫继红，吴 杰.蜂胶的研究进展[J]. 养蜂科技，2003（6）：19.

[4] 王亚群，任永新.蜂胶产品的开发[J]. 中国食物与营养，2007（3）：20-21.

[5] 玄红专，顾美儿.蜂胶的生物学活性及在现代医学上的应用[J].聊城大学学报（自然科学版），2004，17（4）：61-64.

[6] 玄红专，胡福良.蜂胶抗氧化活性的测定方法[J].中国蜂业，2009， 60（5）：29-30.

[7] 兰桃芳，孟良玉，白凤翎，等.蜂胶提取液的抑菌作用研究[J].食品科学，2006，27（12）：225-226.