冠心病心绞痛血瘀证的血浆双向电泳-质谱研究
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇冠心病心绞痛血瘀证的血浆双向电泳-质谱研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘要：目的：进行正常人和冠心病心绞痛血瘀证患者血浆的双向电泳图谱检测，寻找心绞痛血瘀证血浆差异蛋白，探索心绞痛血瘀证的蛋白质组学特点。方法：采用双向凝胶电泳和基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱对6例心绞痛痰瘀互阻证患者、9例心绞痛气虚血瘀证患者和12例正常人血浆进行比较蛋白质组学研究，寻找心绞痛血瘀证血浆差异蛋白。结果：初步发现了Fibrinogen β chain、Fibrinogen γ chain、α1-Antitrypsin、Haptoglobinβ chain在心绞痛痰瘀互阻证和气虚血瘀证患者中均高表达，ApoA-IV、ApoA-I在心绞痛痰瘀互阻证和气虚血瘀证患者中均中低表达。结论：初步发现Fibrinogen β chain、Fibrinogen γ chain、α1-Antitrypsin、Haptoglobinβ chain、ApoA-IV、ApoA-I在心绞痛血瘀证患者和正常人血浆中存在差异表达，但结果有待运用其他生物学的方法进行具体的验证并探索其机制。
关键词：冠心病心绞痛；血瘀证；血浆；双向凝胶电泳；蛋白质组学；生物标志物
中图分类号：R259.414 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)04-0724-03
冠心病已成为我国人民的首要死因。据统计，在冠心病住院患者中，60%首要表现是不稳定性心绞痛(Unstable Angina，UA)。UA已经成为心血管内科最常见的综合征之一，研究冠心病不稳定型心绞痛的防治成为临床亟需解决的一个重大课题。血瘀证是心绞痛中常见的中医证候表现。心绞痛的发病机制现仍然不完全清楚，尚无早期诊断的特异性标志物。近年来蛋白质组学技术的飞速发展，为研究心绞痛的发病机制和探索早期诊断的生物标记物提供了新的思路和技术平台。由于在心绞痛发生、发展过程中，有许多炎症细胞因子以及有关信号通路的小分子蛋白参与，这些蛋白质在心脏中的变化必然会通过相应的途径释放至血液，引起其在血液中的浓度变化，同时也会级联其他一些相关蛋白质发生相应变化，从理论上为心绞痛的血浆差异蛋白质组学研究提供了依据。本研究采用双向凝胶电泳(2-dimensional gel electrophoresis，2-DE)和基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionizationtime of flight mass spectrometry ，MALDI-TOF-MS）技术对心绞痛血瘀证患者和对照组人群血浆进行比较蛋白质组学研究，寻找心绞痛血瘀证发病过程中血浆差异表达蛋白，探索早期诊断的生物标志物，以期为预防和早期治疗心绞痛提供帮助。
1材料与方法
1.1临床资料6例心绞痛痰瘀互阻证、9例心绞痛气虚血瘀证住院患者，男7例，女8例，平均年龄（69±14）岁，均符合美国心脏病学院(ACC)/美国心脏学会(AHA)/美国医师学院及美国内科学会ACP-ASIM联合议定的“慢性稳定型心绞痛诊疗指南(1999年)”以及中华医学会心血管病学分会2000年制订的“不稳定性心绞痛诊断和治疗建议”标准。气虚血瘀证的诊断采用2002年国家食品与药品监督管理局《中药新药临床研究指导原则》制定的标准，痰瘀互阻证为兼有心血瘀阻证和痰阻心脉证者。同时排除以下患者：急性心肌梗死、心肌炎、心脏神经官能症、肋间神经痛；其他疾病引起的心绞痛，如风湿热、梅毒、先天性冠脉畸形、肥厚型心肌病、主动脉瓣狭窄或关闭不全者；合并有脑中风、糖尿病、肺部感染、肾炎、肾衰、泌尿系感染、风湿病、肝、肾、造血系统、内分泌系统等严重疾病及骨关节病者；妊娠期或哺乳期患者，过敏体质患者。12例正常人年龄、性别相匹配，无血瘀证表现，其余基本情况一致。
1.2样品采集15例病人均于入院2天内取清晨空腹肘静脉血2mL，EDTA抗凝，经4℃，3000r/min，离心10min。取上清，分装，-80℃保存。正常人也于清晨取空腹肘静脉血，方法同上。
1.3材料pH4～7固相pH梯度干胶条（IPG）、IPG buffer（pH4～7）、3-[（3-胆酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸（CHAPS）、二硫苏糖醇（DTT）、矿物油、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠（SDS）、考马斯亮蓝R350购自美国GE公司，过硫酸铵（AP）、琼脂糖（Agarose）、甘氨酸（Glycine）购自美国Amresco公司，其它试剂购自北京试剂公司。实验用水为Milli－Q去离子水。
1.4仪器Ettan IPGphorⅡ等电聚焦仪、Ettan DALT six双向垂直电泳仪、Multi TempⅢ温控循环水浴、EPS601电源，均为美国GE公司产品。质谱仪为bruker公司 Ultraflex tof/tof。
1.5分析软件Imagemaster 6.0，GE healthcare。
1.6双向电泳参照Amersham公司双向电泳手册和Gorg等的方法进行。采用IPG预制胶条24 cm pH3～10NL和4～7)。用Bradford法进行蛋白定量，再用水化液调整到合适浓度后上样。蛋白质上样量1mg，梯度升压，等电聚焦总伏小时为100kVh。平衡后胶条转移至13％十二烷基硫酸钠――聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上进行第2相电泳。16℃恒温，采用恒功率电泳，开始时2.5W/gel，1h；再用15W/gel至溴酚蓝到达凝胶的底部边缘。每个样本至少重复电泳3次，以保证实验的稳定性。
1.7凝胶的染色电泳结束后，凝胶固定过夜，R350染色液加热至90℃染色10min，脱色至背景透明。
1.8胶图扫描及图像分析凝胶通过UMAX 2100XL扫描，胶图数据存储后，采用Imagemaster 2D Platinum 6.0软件进行凝胶的蛋白点检测及匹配，配合三维图象、Histogram及人工校对等方法，以保证点检测及匹配的准确性。
1.9质谱鉴定切割蛋白质点置于Eppendorf管中，进行胶内蛋白质酶解后，将从蛋白质差异点抽提所得的肽段通过bruker质谱仪进行分析，获取蛋白样品的肽质量指纹图(由北京华大蛋白质组研发中心完成)，最后应用Mascot软件在人类蛋白质公共数据库(NCBI、SWISS-PROT)中搜寻，获得蛋白质的相关信息。
2结果
2.1双向电泳与图像分析结果经Imagemaster 2D Platinum 6.0软件进行图像的强度校正、点检测、匹配等分析，根据3倍差异表达作为标准，共检测出23个差异点。主要的5个差异区域见图1，主要差异点具体见图2和图3。
2.2差异蛋白点的质谱分析及搜库结果对差异蛋白点进行酶解、质谱分析，得到6张肽质量指纹图谱，质谱图的质量较高，峰信号较强，见图4。用Mascot软件搜索鉴定出6种蛋白质。其中Fibrinogen β chain、Fibrinogen γ chain、α1－Antitrypsin、Haptoglobinβ chain在心绞痛血瘀证患者血浆中高表达，ApoA-IV、ApoA-I在心绞痛血瘀证患者血浆中低表达。
蛋白质谱搜库鉴定结果见表1。
3讨论
据估计，人类血浆中包含数百万种蛋白质[1]，它们与人体的状态密切相关，疾病发生时，人体器官病理变化的产物可释放入血，导致血浆蛋白在结构和数量上的改变，因此，研究在疾病状态时的人体血浆蛋白质组变化有着非常重要的意义。
Haptoglobin、α1-antitrypsin（α1-AT）、Fibrinogen均为急性时相反应蛋白。Haptoglobin作为一种急性期蛋白，在多种应激状态时(如感染、新生物、怀孕、休克、急性心肌梗死等)血浆浓度升高。α1-AT是人类血浆中最丰富的蛋白酶抑制因子，是主要的炎性反应蛋白之一。α1-AT作用广泛，在不同的条件下分别表现为抗炎或促炎为主的活性。α1-AT在缺血再灌损伤的急性期表达增高，被认为发挥抗炎、抗凋亡的作用，是缺血预适应第二时间窗保护作用的机制之一[2]。Fibrinogen是肝脏合成的一种血浆球蛋白，是体内重要的凝血因子。近年来大量临床及流行病学研究发现，血浆Fibrinogen水平升高是CHD发病的一个独立危险因素和炎症活性的标志[3]，并且与冠状动脉粥样硬化严重程度密切相关。Fibrinogen升高提示机体纤溶活性降低，可增加血液黏稠度，促进血小板聚集和血栓形成，增大粥样斑块，甚至堵塞管腔。
ApoA-I是高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）的主要蛋白成分，而HDL水平与冠心病之间的负相关，大量临床和流行病学研究证实ApoA-I的降低是心肌梗死（myocardial infarction，MI）的独立危险因素。ApoA-IV是一种脂结合蛋白，ApoA-IV的主要作用是参与脂质代谢，ApoA-IV通过介导HDL与肝细胞的结合以及被摄取，参与了胆固醇逆向转运[4]。ApoA-IV使HDL含量升高并改变其成分，进而影响脂蛋白的代谢，促进细胞内脂质外排，从而发挥抗动脉粥样硬化作用[5]，也有观点认为ApoA-IV可以通过不依赖于升高HDL的途径起到抗动脉粥样硬化的作用[6]。此外，ApoA-IV还具有抗炎作用[7]，可以阻止P-选择素介导的白细胞与血小板之间的黏附[8]。
综上所述，本研究采用2-DE和MALDI-TOF-MS技术对心绞痛和对照组人群血浆进行比较蛋白质组学研究，建立了相应的双向电泳、质谱鉴定和生物信息学分析技术路线，初步发现了Fibrinogen β chain、Fibrinogen γ chain、α1-Antitrypsin、Haptoglobin β chain、ApoA-IV、ApoA-I在心绞痛血瘀证患者血浆中存在差异表达。这些差异表达的蛋白质究竟属于一过性的差异表达，还是作为心绞痛血瘀证的病理基础，及其是否具有特异性，尚不得而知。且由于目前的研究仅仅是蛋白质组学初筛试验，还需利用其他生物学方法如Western-blot、ELISA或RT-PCR进行个体验证，并进一步扩大样本例数、探索其与心绞痛血瘀证发病机制的具体关系，以期能为预防和早期治疗心绞痛提供参考。
参考文献
［1］Anderson NL, Anderson NG. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects［J］. Mol Cell Proteomics, 2002, 1(11): 845-867.
［2］Marc A. R. C. Daemen, Vincent H. Heemskerk, Cornelis van’t Veer, Geertrui Denecker, Tim G. A. M. Wolfs; Peter Vandenabeele, et al. Functional Protection by Acute Phase Proteinsα1-Acid Glycoprotein and α1-Antitrypsin Against Ischemia/Reperfusion Injury by Preventing Apoptosis and Inflammation［J］. Circulation，2000，102：1420.
[3]James J S,Halit S, Geoffrey HT, et al . Association of fibrinogen with cardiovascular risk factors and cardiovascular disease in the framing ham offspring population[J] .Circulation ,2000 ,102 :1634 - 1638.
[4]Elena Dvorin, Nancy L Corder, Douglas M Benson, Antonio M Gotto. Apolipoprotein A-IV: a determinant for binding and uptake of high density lipoproteins by rat hepatocytes［J］.Biological chemistry,1986,261(33):15714-15718.
[5]Robert D. Cohen, Lawrence W. Castellani, Jian-Hua Qiao, et al. Reduced Aortic Lesions and Elevated High Density Lipoprotein Levels in Transgenic Mice Overexpressing Mouse Apolipoprotein A-IV［J］. Clin. Invest. ,1997,99: 1906-1916.
[6]Nicolas Duverger, G nter Tremp, Jean-Michel Caillaud, et al. Protection Against Atherogenesis in Mice Mediated by Human Apolipoprotein A-IV［J］. Science, 1996, 273 (5277): 966-968.
[7]Recalde, D. , M. A. Ostos, E. Badell. Scott-Algara. Human apolipoprotein A-IV reduces secretion of proinflammatory cytokines and atherosclerotic effects of a chronic infection mimicked by lipopolysaccharide［J］. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. , 2004, 24: 756 761.
[8]Thorsten Vowinkel, Mikiji Mori1, Christian F Krieglstein,et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis［J］. Clin. Invest, 2004, 114: 260-269.