CoQ10对DA损伤PC12细胞保护作用的实验研究

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[摘要] 目的：探讨辅酶Q10（coq10）在以PC12细胞建立的多巴胺神经元损伤细胞模型中的作用。方法：实验于2007年4月～2008年4月在辽宁医学院科技实验中心进行。在体外培养PC12细胞的条件下，加入多巴胺以损伤PC12细胞，同时加入一定浓度的CoQ10，检测细胞的生长活力及培养液Mda含量，比较多巴胺损伤的pc12细胞在加与不加CoQ10时损伤的差异。结果：CoQ10+多巴胺组PC12死亡率及MDA含量较多巴胺组显著降低（P＜0.05）。结论：CoQ10能减轻多巴胺对PC12细胞的损害。

[关键词] CoQ10；大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞；帕金森病；细胞凋亡

[中图分类号] R742.5[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）06（c）-028-03

Experimental study on the protective effect of CoQ10 on damaged PC12 cells induced by DA

LI Xidong1, LIU Xing2, SUI Rubo1, ZHAO Baodong3

(1.Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, China; 2.Jinzhou Red Cross Blood Center, Jinzhou 121000, China; 3.Department of Anatomy, Liaoning Medical College, Jinzhou 121000, China)

[Abstract] Objective: To discuss the influence of CoQ10 on the model of dopaminergic neuron based on PC12 cells. Methods: The experiment was done in the experimental center of science and technology of Liaoning Medical College from April 2007 to April 2008. DA was used to damage the cultured PC12 cells and a certain concentration of CoQ10 was added in the medium used to culture PC12 cell in vitro. The level of MDA in PC12 cells and the cell growth vigor were measured to compare the difference between the damaged PC12 cells by DA with and without CoQ10. Results: The mortality rate and the level of MDA in CoQ10 and DA group were remarkably decreased compared with that of DA group (P＜0.05). Conclusion: CoQ10 can reduce the injury of PC12 cells induced by DA.

[Key words] CoQ10; PC12 cells; Parkinson's disease; Cell apoptosis

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是中老年人常见的神经退行性疾病，其病理基础是选择性中脑黑质多巴胺神经元丧失，导致纹状体多巴胺含量显著减少。早期用多巴胺（dopamine，DA）替代疗法无法控制病情的发展，长期应用常会带来副作用[1]。因此，探索有效的神经保护治疗方案很有必要。辅酶Q10（coenzyme Q10，CoQ10）异常可能是PD的病因[2]。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（pheochromocytoma cell，PC12）株，其性质与儿茶酚胺细胞相似，而且细胞内含有的酶类、合成的递质等方面很接近于中脑多巴胺神经元。因此，本研究以PC12细胞作为DA神经元的细胞模型，研究CoQ10在体外的直接作用，试图为其应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 设计

以PC12细胞株为研究对象，设计随机对照实验。

1.2 地点和材料

1.2.1 地点实验于2007年4月～2008年4月在辽宁医学院科技实验中心进行。

1.2.2 药品及仪器CoQ10：卫材（苏州）制药有限公司；RPMI 1640：GIBCO公司；MDA检测试剂盒：南京建成生物公司。其他试剂为国产分析纯级产品。二氧化碳孵箱为美国Forma Scieutitic公司产品；超净工作台为国产TDGC-2J-1型。

1.2.3实验对象及分组PC12细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所。实验分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 5组，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组为实验组：CoQ10+DA组；Ⅳ为实验对照组：DA组；Ⅴ为空白对照组。

1.3设计、实施、评估者

实验设计、资料收集及评估由本文所有作者共同完成，均经过正规培训。

1.4干预措施

1.4.1 PC12细胞传代培养PC12细胞置于RPMI 1640培养液中，内含0.1%小牛血清，谷氨酰胺2 mmol/L，青霉素50 000 U/L，链霉素25 mg/L，放于37℃、0.05%的CO2孵箱内培养。当细胞分裂旺盛、布满瓶底时，进行消化传代操作：吸出培养液，加入1 ml 2.5 g/L的胰蛋白酶，在倒置显微镜下观察到细胞间隙加大、胞体回缩时，加入少量含血清培养基终止消化。吸出含消化液的培养基，加入数毫升无血清培养基反复吹打制成单细胞悬液，接种于新培养瓶内，一般在无加药处理时1瓶传代4瓶。36 h换液1次，间隔72 h传代，加药处理在细胞对数增长期进行。

1.4.2 细胞生长活力检测消化培养细胞，制成1.5×105个/ml密度、含10%小牛血清的单细胞悬液，分别接种于5 ml培养皿中，每个培养皿加入3 ml悬液，置于CO2孵箱内培养。分组及用药情况见表1。

表1 PC12细胞生长活力及培养液MDA检测时的分组和用药

各组分别于12、24、36、48 h时段取3个皿，将其内培养的细胞制成单细胞悬液，于计数板上计数。每个皿计数3次，取均值。最后以每次各组3个皿计数的均值绘制细胞生长曲线。

1.4.3 培养液MDA检测将细胞以1×106个/ml密度接种于96孔板内，分组及用药见表1，每组样本数为6。24 h后按照MDA试剂盒说明书操作，测定各组细胞培养液在532 nm处吸光度值，然后按公式：样本MDA含量（nmol/ml）=（测定管吸光度－测定空白管吸光度）/（标准管吸光度－标准空白管吸光度）×10 nmol/ml计算。测定管内为各组培养液。

1.5 主要观察指标

CoQ10对DA所致PC12细胞损伤的影响。

1.6 统计学方法

数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析进行组间比较，数据处理均应用SPSS 10.0软件包完成，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞生长活力检测

PC12细胞培养液中加入DA 12 h后，其成活细胞数明显少于Ⅴ组（P＜0.01），而同时加入CoQ10，成活细胞数明显增加，并且与剂量呈正相关，当剂量增加到450 μmol/L时，细胞数与空白对照组比较，已无显著性差异（P＞0.05）。结果见表2，生长曲线见图1。

表2 不同浓度的CoQ10与DA对PC12细胞活力的影响（×105个/ml）

与Ⅳ组比较，#P＜0.05， ##P＜0.01

2.2 CoQ10对培养液MDA含量的影响

在PC12细胞培养液中加入0.30 mmol/L的DA和不同浓度（50、150、450 μmol/L）的CoQ10，24 h后测定培养液中的MDA含量。结果表明，随着CoQ10浓度的增加，MDA值逐渐减小，呈负相关，说明CoQ10可减轻脂质过氧化反应，见表3。

表3 PC12细胞经DA和CoQ10处理后24 h培养液MDA含量

与Ⅳ组比较，*P＜0.01

3 讨论

3.1自由基损伤对DA神经元死亡的影响

PD是中老年人常见的神经退行性疾病，其病理基础是选择性中脑黑质多巴胺神经元丧失，导致纹状体DA含量显著减少。氧化应激、线粒体功能障碍及细胞凋亡都是引起PD的可能原因[3-4]。在PD患者黑质DA神经元线粒体中，CoQ10含量显著低于正常人[2]。Yoo等[5]研究发现，氧化应激参与了PD线粒体复合物Ⅰ的损伤过程。自由基生成增多，导致黑质DA神经元的过氧化损伤，自由基生成增多在DA神经元损伤机制中占有越来越重要的地位。MDA是脂质过氧化过程中的一种稳定产物，其值的高低直接反映被检物质脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。本研究检测了PC12细胞培养液中MDA含量，各实验组和对照组比较，有显著性差异（P＜0.01），至少从模型水平证明PD确实存在脂质过氧化过度。自由基包括超氧化物自由基、过氧化物自由基、羟自由基（・OH），其中・OH毒性最大。在生理状态下产生的自由基一般由超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶及谷光甘肽过氧化物酶（GSH-PX）清除。中脑脑组织的抗氧化能力相对低于其他脑区，Agid等[6]研究指出，GSH-PX在中脑的分布是不均的，PD中受损最严重的黑质致密部分布最少。在此基础上，多种因素促使PD患者自由基生成增多。首先PD患者黑质中线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ活性明显降低，且主要位于黑质致密部[7]。线粒体是细胞的产能中心，也是自由基产生的重要场所，呼吸链的任何环节缺陷都引起自由基生成增多。其次，为了代偿DA神经元减少所引起的DA递质不足，残存的DA神经元生成DA增加，使DA更新率增高。而多巴胺在代谢过程中产生氧自由基、・OH等自由基及过氧化氢、6-OHDA等这样的具有自由基毒性的代谢产物。PD患者黑质中铁含量较对照组增高50%，而且主要分布在黑质致密部。铁离子能催化过氧化氢形成 ・OH。另外，钙超载的细胞毒作用、神经系统老化、神经毒素等都是自由基增加的促发因素。

3.2 CoQ10的抗氧化及其对PD的抗凋亡作用

CoQ10在细胞内主要分布于线粒体内，是哺乳动物线粒体内膜呼吸链中重要的氧化还原成分，是线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ的电子接受体。在细胞耦联磷酸化和线粒体呼吸链电子传递中起传递电子的作用[8-9]。

外源性CoQ10的补充纠正了病变组织的CoQ10缺乏状态，其抗氧化机制主要有：第一，自由基清除作用。外源性CoQ10能非特异性地与细胞某些部位相结合，增强了琥珀酸-细胞色素C还原酶活性，提供电子给超氧阴离子，使其被还原为氧原子，清除氧自由基。也有可能是CoQ10增强了SOD、GSH-PX等自由基防御系统的功能。此外，还有报道在膜水平上CoQ10具有直接抗自由基脂质过氧化的作用[10]。第二，促进线粒体生成ATP。细胞内CoQ10水平对维持线粒体呼吸链功能是一种限定因素，当CoQ10缺乏时可影响线粒体的氧化磷酸化，使ATP生成减少，线粒体功能低下。及时补充外源性CoQ10有利于呼吸链电子转化功能的恢复，增强线粒体生成ATP的能力。第三，稳定细胞的膜结构，维持钙通道的完整性。CoQ10可能通过抑制线粒体膜上的磷脂酶A2减轻自由基对膜的损害，CoQ10还能增加ATP生成，为生物膜维持正常结构提供能量，间接稳定钙通道。

本实验比较了各组PC12细胞培养液中MDA含量，CoQ10组显著低于对照组，可以认为CoQ10具有减轻PC12细胞脂质过氧化反应的作用，这与国外一些研究CoQ10能减慢帕金森病发展的结果一致[11-12]。其机制可能是：外源性CoQ10通过保护线粒体膜和嵴，保持线粒体结构完整而维持其氧化磷酸化功能，减少自由基生成，同时，作为一种抗氧化剂，它有效清除了脂质过氧化产生的自由基，抑制磷脂酶A2对细胞膜磷脂的分解，对生物膜起保护和稳定作用。

本实验结果表明，CoQ10能显著降低DA引起的PC12细胞损害，这一结果提示，CoQ10作为神经保护性药物对保护DA能神经元、防治PD可能有实际应用价值。

[参考文献]

[1]Jankovic J. Levodopa strengths and weaknesses [J]. Neurology,2002,58(4 Suppl 1):19-32.

[2]Shults CW, Haas RH, Passov D, et al. Coenzyme Q10 levels correlate with the activities of complexes Ⅰ and Ⅱ/Ⅲ in mitochondria from parkinsonian and nonparkinsonian subjects [J]. Ann Neurol,1997,42(2):261-264.

[3]Stocchi F, Olanow CW. Neuroprotection in Parkinson's disease: clinical trials [J]. Ann Neurol,2003,53(Suppl 3):87-99.

[4]Ravina BM, Fagan SC, Hart RG, et al. Neuroprotective agents for clinical trials in Parkinson's disease: a systematic assessment [J]. Neurology,2003,60:1234-1240.

[5]Yoo MS, Chun HS, Son JJ, et al. Oxidative stress regulated genes in nigral dopaminergic neuronal cell: correlation with the known pathology in Parkinson's disease [J]. Brain Res Mol Brain Res,2003,110(1):76-84.

[6]Agid Y, Ruberg M, Javoy-Agid F, et al. Are dopaminergic neurons selectively vulnerable to Parkinson's disease [J]. Adv Neurol,1993,60:148-164.

[7]赵春玉,赵宝东,王雅君,等.辅酶Q10在帕金森病治疗中的应用[J].中华神经科杂志,2003,36(4):314.

[8]Ken S, Masanori W, Yoshito S, et al. Application of photosynthetic bacteria formedical fields [J]. Biosci Bioengin,2005,100(5):481.

[9]Mskoto K. Biosynthesis, bioproduction and novel roles of ubiquinone [J]. BiosciBioengin,2002,94(6):533.

[10]Viswanath V, Wu Y, Boonplueang R, et al. Caspase-9 activation results in downstream caspase-8 activation and bid cleavage in 1-methyl-4-pheny1-1,2,3,6-tetrahydro-pyridine-induced Parkinson's disease [J]. Neurosci,2001,21(24):9519-9528.

[11]Shults CW, Oakes D, Kieburtz K, et al. Effects of coenzyme Q10 in early Parkinson disease: evidence of slowing of the functional decline [J]. Archives of Neurology,2002,59(10):1541-1550.

[12]Hunter DA. Coenzyme Q10 in early Parkinson disease[J]. Archives of Neuro-logy, 2003,60(8):1170.

（收稿日期：2009-05-07）